大阪大学大学院工学研究科の天満健太　助教、桶谷亮介　特任研究員（常勤）(研究当時／現:九州大学理学研究院助教)、藤田克昌　教授らの研究グループは、同大学産業科学研究所の永井健治　教授、大学院医学系研究科の上西達也　助教、大学院生命機能研究科　濱﨑万穂　准教授、ドイツ・イエナ大学のRainer Heintzmann教授らと共に、生体内部を観察できる新たな超解像顕微法を開発することに成功しました。従来の超解像顕微法の多くは、焦点外からの背景光が多く発生する生体内部の観察への利用は難しく、主に試料の表層付近や薄い生体試料の観察に用途を制限されてきました。

今回、本研究グループは、薄いシート状の照明と、光スイッチング蛍光タンパク質を用いて選択的に発光領域を限定するシートアクティベーション型構造化照明顕微法(Selective-plane-activation structured illumination microscopy, SPA-SIM)を開発しました。この顕微法は、試料の発光を観察対象面に限定することで背景光の発生を抑制し、そこに縞状の光を照明することで生体内部の超解像観察を可能とします。

本研究では、開発した技術を用いて、従来手法では観察の難しい立体的な形状の細胞スフェロイドの内部構造を超解像観察することに成功しました（図１）。本技術は単一細胞内部の詳細な観察が可能であるのみでなく、近年関心を集めている3D多細胞組織(スフェロイド、オルガノイド)の観察に利用可能です。これらの試料を用いた、生物、医、薬学研究への幅広い貢献が期待されます。

本研究成果は、英国科学誌「Nature Methods」に、４月５日（金）１８時（日本時間）に公開されました。

図1. 細胞スフェロイド(直径100µm、深さ43µmでの観察)の蛍光像。
従来の光学顕微法(左上)と開発法SPA-SIM(右下)

超解像顕微法は高い解像度で生体を観察するのに有効な技術です。中でも縞状の光を照明して空間分解能を向上させる構造化照明顕微鏡(SIM) は、比較的弱い光強度で低侵襲に高速な観察を行うことができるため、生体の構造や動態を観察するのに広く用いられています。しかし、生体内部では観察用対物レンズの焦点外から発生する背景光が観察の妨げとなるため、観察対象は試料の表層付近に限られていました。

本研究グループでは、観察用対物レンズの焦点よりも薄いシート状の照明と、発光状態のon/offを切り替え可能な光スイッチング蛍光タンパク質を用いて、選択的に発光する領域を限定することで生体内部における背景光の発生を抑制することに成功しました。さらに、限定した発光領域に縞状の光を照明し蛍光を検出することで生体内部を超解像観察可能なシートアクティベーション型構造化照明顕微法(SPA-SIM)を開発しました (図2)。実験では、開発した顕微法を用いて生きた細胞の3D観察を行い、従来法では背景光が重なり見えづらい構造が明瞭に観察できるようになったことを確認しました(図3)。さらに従来法では観察が難しかった細胞スフェロイドの内部構造を超解像観察することに成功しました(図4)。また、開発した顕微法は観察面内方向に140nm、奥行き方向に300nmという三次元的に高い空間分解能を有することを理論、実験的に確認しています。

図2. SPA-SIMの対物レンズ配置(左上)。蛍光イメージングの過程(右上)。シート照明により発光領域を決定し、そこに縞状の光を照明する。シートで照明した領域からのみ蛍光が発生する。(下図)蛍光発光分布のシミュレーション結果。
観察方向(z)の発光領域が限定される。

図3. 細胞の３D蛍光像。開発したSPA-SIM(上)では従来の超解像顕微法(下)に比べ明瞭な観察が可能。

図4. 細胞スフェロイド(直径100µm、深さ43µmでの観察)の蛍光像。通常の蛍光顕微鏡(左)では観察できない試料内部の構造をSPA-SIM(真ん中)では明瞭に観察可能。また従来の超解像顕微法(右)では観察は不可能。

本研究成果により、従来の超解像顕微法の利用が及ばなかった生体内部の観察が可能となりました。これは顕微観察技術の進展において重要なマイルストーンとなります。また近年、細胞スフェロイドやオルガノイドと

いった3D多細胞組織が生体発生や、疾患の原因究明、また生体の薬剤応答の観察といった幅広い分野の研究において関心を集めていますが、詳細な空間分布を観察することは困難でした。本研究はこれらを高い空間分解能で生きたまま観察可能であり、これまで見ることができなかった現象を明らかにできる新たな技術となることが期待されます。

本研究成果は、2024年４月５日（金）１８時（日本時間）に英国科学誌「Nature Methods」（オンライン）に掲載されました。

タイトル：“Selective-plane-activation structured illumination microscopy”
著者名：Kenta Temma†, Ryosuke Oketani†, Toshiki Kubo, Kazuki Bando, Shunsuke Maeda, Kazunori Sugiura, Tomoki Matsuda, Rainer Heintzmann, Tatsuya Kaminishi, Koki Fukuda, Maho Hamasaki, Takeharu Nagai and Katsumasa Fujita
ＤＯＩ：https://doi.org/10.1038/s41592-024-02236-3

本研究は、科学技術振興機構（JST） 戦略的研究推進事業CREST(JPMJCR1925、JPMJCR15N3)、共創の場形成支援プログラムCOI-NEXT(JPMJPF2009)、文部科学省科学研究費助成事業新学術領域研究(18H05410)、物質・デバイス領域共同研究拠点の支援を得て行われました。

大阪大学大学院工学研究科藤田研究室　
https://lasie.ap.eng.osaka-u.ac.jp/home_j.html

大阪大学産業科学研究所永井研究室
https://www.sanken.osaka-u.ac.jp/labs/bse/index.html

大阪大学先導的学際研究機構
https://otri.osaka-u.ac.jp

大阪大学大学院工学研究科附属フューチャーイノベーションセンター
https://www.cfi.eng.osaka-u.ac.jp/