生体チオール量の変化は種々の疾患に関連しており、細胞内の特定の位置における生体チオール量を調べることは重要です。細胞内の分子を観察するためには目印が必要であり、一般的には蛍光色素を目印として連結させた蛍光プローブが利用されます。生体チオール検出用の蛍光プローブは、観察対象や可視化の手法に合わせて選択する必要があり、これまでに80種類以上の蛍光プローブが開発されています。ただし蛍光色素は比較的大きな構造（分子量200以上）を持つため、蛍光プローブの小型化には制約がありました。

東北大学大学院薬学研究科の山越博幸助教らの研究グループは、蛍光色素を用いない、世界最小の生体チオール検出プローブThioRas（チオラス：分子量167）を開発しました。ThioRasは生体チオールと結合すると、ラマン散乱光の波数が変化する性質を持ち、これをラマンイメージングすることで、チオール濃度を測定できました。小さくて水溶性に優れるThioRasは、細胞実験において均一な分布特性を示します。この特性から、今後、複数部位の生体チオール濃度を同時に測定するためのツールとして利用されることが期待されます。

本研究の成果は、2023年11月21日に科学誌Chemical Communicationsにオンライン掲載されました。

なお本成果は、東北大学大学院薬学研究科柴田大輝大学院生、梶本真司准教授、髙山亜紀助教、岩渕好治教授、中林孝和教授、大阪大学大学院工学研究科の畔堂一樹特任研究員、藤田克昌教授、理化学研究所開拓研究本部および環境資源科学研究センターの江越脩祐研究員、闐闐孝介専任研究員、袖岡幹子主任研究員との共同研究によるものです。

細胞内の分子を観察するためには目印が必要であり、一般的には蛍光色素を連結させた蛍光プローブが用いられます。蛍光色素から生じる蛍光は、高感度な検出が可能です。一方、蛍光プローブとは異なる観察手法として、近年、ラマンプローブが注目されはじめています。ラマンプローブの場合には、ニトリルなどの微小構造を目印にします。検出するラマン散乱光は蛍光と比べて微弱ですが、観察対象分子の構造情報をより多く与えることが特徴です。このように、ラマンプローブは蛍光プローブと相補的な研究ツールであり、更なる発展が期待されています。そこで、当該研究グループは、新しい概念に基づくラマンプローブの開発を進めています。

上記の背景をもとに、私たちは生体チオールの検出に焦点を当て、αシアノアクリル酸エステル構造を持つ分子（αCNA）に注目しました。αCNAは、生体チオールと迅速に結合する性質を持つことが知られています。一方で、αCNAとチオールとの結合により生成される化合物（チオール付加体）のニトリル構造に由来するラマン散乱の波数が約20 cm^–1異なるという興味深い性質は、これまで見落とされていました（図１）。そこで、私たちは二つの異なる波数のラマン散乱光をラマンイメージングにより区別し、検出できる可能性を考えました。αCNA構造を持つ分子とチオール付加体の比率はチオール濃度に依存して変化するため、二種類のラマン散乱光を測定し、その割合からチオール濃度が求められます。

本研究ではまず、様々なαCNAとチオールの組み合わせでαCNAとチオール付加体のピーク比が算出できることを示しました。続いて、検討したαCNAの中で、最も小さな構造を持つ化合物をThioRasと名付け、その機能を更に調べた結果、水に溶けやすい性質を持つことがわかりました（図2）。

次に、細胞溶解液中でThioRasと生体チオールの代表例であるグルタチオンを混合し、チオール付加体の比率を求めました。同実験から、種々の夾雑物を含む条件でもチオール付加体を検出できることがわかりました。また、溶液にチオール捕捉剤を添加することで惹起される化学平衡の変化を検出可能なこともわかりました。

HeLa細胞に添加したThioRasの分布をラマンイメージングにより調べた結果、拡散した分布が観察されました。小さくて水溶性に優れるThioRasの特性を反映した分布と考えられます。最後に、HeLa細胞の核、細胞質、脂肪滴中のチオール濃度を測定し、培地中よりもチオールが高濃度であることを示しました。

図1. αCNAとチオール付加体のラマン散乱光は波数が異なる

図2. 小型化された生体チオール検出プローブThioRasの構造

本研究では、αCNAが持つニトリル構造のラマン散乱光に着目し、最小型の生体チオール検出プローブThioRasを開発しました。ThioRasは、生体チオールに起因する疾病に関連する生化学的プロセスを研究に応用されることが期待されます。また、αCNAの中には、疾患原因タンパク質のシステイン残基を標的とする医薬品候補化合物も報告されています。したがってラマン散乱光の波数変化に着目した本研究のアプローチは、同群医薬品候補化合物の機能解析への応用も期待されます。