大阪大学産業科学研究所の服部満准教授、永井健治教授らの研究グループは、慶應義塾大学の蛭田勇樹准教授とともに、生物発光の波長 (色) を自在に変化させ、個々の細胞を標識することで、複数の細胞を同時に観察する新たな手法を確立しました。

細胞集団において個々の細胞を識別する方法は、細胞運命や薬剤応答など細胞の個性の違いが注目されている現在、その重要性が高まっています。従来の蛍光標識による方法では識別できる数に限りがあり、また対象が増えるほどより複雑な観察システムを必要とします。生物発光の利用は蛍光観察の課題を克服できる可能性があるものの、発光色の種類は十分ではなく、観察方法にも課題がありました。

今回、研究グループは、生物発光色を変化させる新たな方法を開発することで、これまででは最大の20色の生物発光タンパク質シリーズ「eNLEX」を開発しました (図1)。

さらにカラーカメラによる撮影方法を導入することで、異なる色で発光する複数の細胞を、生きたまま同時に観察することにも成功しました。

本研究成果は、2025年1月23日（木）午前4時（日本時間）に米国科学振興協会の学術誌『Science Advances』（オンライン）に掲載されました。

図1. 20色の生物発光タンパク質 “eNLEX”
本論文で開発した生物発光の色を変化させる方法 (上)および開発した20色のeNLEXが発光する様子 (下)。
撮影はスマートフォンカメラにより行った。

無数の細胞で構成される多細胞生物では、同じように見える細胞でもそれぞれに個性があることが知られています。細胞運命の追跡や、他とは特徴量が異なる細胞の同定など、個々の細胞を識別する方法は様々な目的において必要とされます。顕微鏡による観察では、異なる波長をもつ蛍光物質でそれぞれの細胞を標識する方法が一般的に用いられます。蛍光は励起光の波長に応じて発生するため、複数の蛍光種を観察する際には光学フィルターを組み合わせた制御が必要です。ただし、波長が近い場合には正確な分光は困難となるため、画像の撮影後に計算処理を行わない限り、標識できる細胞数には限りがありました。

ホタルの光に代表される生物発光は、生物発光タンパク質が発光基質と反応する際に自発的に生じる光です。蛍光とは違い励起光の照射が不要なため、背景光が少ない、光毒性の懸念が無いなどの利点を有しています。したがって、その発光波長 (色) の種類が十分に準備されれば、細胞標識への利用に大きな可能性を持ちます。しかしながら、生物発光を細胞識別の標識に用いたとしても、従来の分光方法では検出できる色の数に限界がありました。

まとめると、生物発光を用いた細胞識別法の確立には、１. 生物発光の発光色を増やす方法、2. 多数の発光色を同時に検出する方法、の２点が課題となっていました。

研究グループは生物発光の発光色を増やすために、以前開発した生物発光タンパク質enhanced Nano-Lantern (eNL) を基盤にしました。eNLは青色生物発光タンパク質NanoLucに蛍光タンパク質を繋げることで、生物発光エネルギー共鳴移動 (Bioluminescence resonance energy transfer, BRET) を引き起こし、その発光色を変化させています。本論文では、eNLにさらに蛍光タンパク質を繋げることで複数のBRETを誘導し、より複雑な発光色を作り出すことに成功しました。最終的に20色にまで発光色のバリエーションを増やし、この生物発光タンパク質シリーズをeNLEX (eNL expansion)と名付けました。

光学フィルターを切り替えてモノクロカメラで検出する従来の方法では、20色のeNLEXの発光色を同時に観察することは不可能です。そこで検出の手段として、スマートフォンなどに装備されているカラーCMOSカメラを用いました。これらのカメラは、検出素子であるCMOSセンサー上にRGB (赤・緑・青) を基本とするフィルターが並んでおり、観察対象から発せられる光を、フィルターを通して検出することで、発光の波長情報を記録することができます。このカラーCMOSカメラを顕微鏡に設置して、細胞観察での実用性を検証しました。eNLEXそれぞれをヒトの培養細胞へ導入して観察した結果、個々の細胞から発せられる20色の発光が同時に観察可能であることが示されました (図２A、B)。eNLEXとカラーCMOSカメラを組み合わせた撮影は、細胞以外にも細胞内小器官の識別から、小動物の組織レベルに至るまで、様々なスケールの観察対象に対して実行できます。

また、撮影した画像からRGB情報を基にそれぞれの発光色を分離することにも成功しました。さらに生きた細胞内での複数の対象について、eNLEXでそれぞれ標識することでその経時的な変化を同時に観察することも可能であり (図2C)、簡便なシステムでタイムラグのない観察を実現しました。

図2. eNLEXを導入したヒト培養細胞の生物発光観察
(A) 20色のeNLEXを発現するそれぞれの細胞。スケールバー：20 µm。(B) 各色の細胞を混合した状態。スケールバー：100 µm。(C) 経時変化の観察 (時：分)。スケールバー：100 µm。全ての撮影はカラーCMOSカメラにより行った。

本研究成果での簡便で低コストな観察システムにより、複数の細胞の同時観察が可能となるため、基礎研究のみならず再生医療研究や創薬分野への導入拡大が期待されます。

本研究成果は、2025年1月23日（木）午前4時（日本時間）に米国科学振興協会の学術誌『Science Advances』（オンライン）に掲載されました。

タイトル：“Creating coveted bioluminescence colors for simultaneous multi-color bioimaging”
著者名：Mitsuru Hattori, Tetsuichi Wazawa, Mariko Orioka, Yuki Hiruta, and Takeharu Nagai
ＤＯＩ：10.1126/sciadv.adp4750

本研究は、文部科学省、日本学術振興会、科学技術振興機構 (JST)、新エネルギー・産業技術総合開発機構 (NEDO) の支援を得て行われました。