大阪大学大学院医学系研究科の肥後修一朗　特任准教授（常勤）（重症心不全内科治療学共同研究講座）、坂田泰史　教授（循環器内科学）らの研究グループは、ベッカー型筋ジストロフィーが重症心不全をきたすメカニズムを、iPS細胞由来分化心筋細胞を用いて解明しました。今回研究グループは、補助人工心臓が必要な重症心不全に至ったベッカー型筋ジストロフィー女性キャリア症例を対象に、心筋組織病理標本を用いた解析、遺伝解析、iPS細胞から分化させた心筋細胞を用いた機能解析を行いました。解析の結果、ジストロフィン遺伝子変異に加え、コラーゲンの生合成に関わるPLOD3の遺伝子変異が存在することで、心臓組織の収縮力に加えスティフネス（硬さ）を低下させ、重症化に関与していることを見出しました。重症心不全の病態解明、今後の治療法開発につながることが期待されます。

本研究成果は、「JACC: Basic to Translational Science」に、2月9日（木）（日本時間）に公開されました。

現在の日本において、心臓移植が必要な重症心不全の原因の多くを拡張型心筋症が占めています。ベッカー型筋ジストロフィーは、ジストロフィン遺伝子の変異により発症する遺伝性の病気で、心不全の原因となる拡張型心筋症の原因となります。ジストロフィン遺伝子はX染色体上に存在するため、X染色体を1本しかもたない男性で発症することが多く、X染色体を2本もつ女性はキャリアとなり、男性に比べ軽症で経過することが多いとされています。ベッカー型筋ジストロフィー女性キャリアが、若くして重症心不全に至ることは極めてまれであり、その原因やメカニズムは明らかではありませんでした。

研究グループは、若くして補助人工心臓が必要な重症心不全に至ったベッカー型筋ジストロフィー女性キャリア症例を見出し、心筋組織病理解析、遺伝解析、iPS細胞由来分化心筋細胞を用いた機能解析を行いました。本症例では、ジストロフィン遺伝子の45番目から48番目のエクソンが抜け落ちる遺伝子変異により、短くなったジストロフィン（Δ45-48ジストロフィン）が作られていることが分かりました。ベッカー型筋ジストロフィー女性キャリアでは、X染色体不活化と呼ばれるしくみにより、全身の組織で、正常なジストロフィンと短くなったジストロフィンがモザイク状に存在していますが、ヒト心臓の組織で同様の現象が起きているかは明らかではありませんでした。補助人工心臓手術時に得られた心筋組織を対象に、エクソン45を認識する抗体で免疫染色を行ったところ、正常ジストロフィンとΔ45-48ジストロフィンがおよそ6:4の比率で作られていることが明らかとなりました（図）。

更に、本症例の重症化メカニズムを明らかにするため、詳しく遺伝子解析を行ったところ、ジストロフィン遺伝子変異に加え、PLOD3遺伝子にストップゲイン変異が生じていることが明らかとなりました。ベッカー型筋ジストロフィー女性キャリアでは、全身の細胞において、2本のX染色体がランダムにX染色体不活化を受けています。研究グループは、このX染色体不活化のしくみを利用することで、血液の細胞から作成したiPS細胞から、正常なジストロフィンまたはΔ45-48ジストロフィンを主に作り出しているiPS細胞を選別することに成功しました。更に、ゲノム編集技術を用いて、同定されたPLOD3遺伝子変異を正常に修復した、遺伝背景が同一のアイソジェニックiPS細胞を作成しました（図）。これら細胞は同一の遺伝背景をもつため、病気の原因となる遺伝子の機能に焦点をあてた解析が可能となります。

作成したiPS細胞を心筋細胞に分化させ、更にリング状に組織化し、上下に伸ばす刺激を加えることで、心筋組織が収縮する力やスティフネス（硬さ）を測定しました。Δ45-48ジストロフィンを作り出す心筋細胞では、正常ジストロフィンを作り出す心筋細胞に比べて収縮力、スティフネスが低下し、PLOD3変異を修復することで、スティフネスが改善することが明らかとなりました（図）。更に、組織の維持に必要なコラーゲンの産生量がPLOD3の欠損により低下し、ゲノム編集で変異を修復することで改善することが明らかとなりました。

図1. 心筋組織におけるジストロフィンタンパク質発現
連続した2つの心臓組織切片を用いた免疫染色像です。ジストロフィンのN末端を検出する抗体はすべてのジストロフィンタンパク質を認識しますが、エクソン45を認識する抗体はΔ45-48ジストロフィンを認識できないため、心臓組織において両者がモザイク状に作られている様子が観察されました。

図2. X染色体不活化機構・ゲノム編集を用いたアイソジェニックiPS細胞の構築
ジストロフィン遺伝子（DMD）は2本のX染色体上にあるため、X染色体不活化のしくみにより、どちらかが働かなくなります。このしくみを利用して、正常(野生型)またはΔ45-48ジストロフィン(DMD)がそれぞれ作られるiPS細胞を作成しました。さらに、ゲノム編集を用いて、PLOD3遺伝子変異を正常に修復したiPS細胞を作成しました。

図3. 三次元組織化リングを用いた心筋収縮力・スティフネスの評価
iPS細胞由来分化心筋細胞からリング状の組織を作成し、伸展させながらモーションカメラで測定することで、心筋組織の収縮力、スティフネス（硬さ）を測定しました。

原因が分からない重症心不全を克服するには、ひとつひとつの症例において、そのメカニズムを解明していくことが必要です。本症例では、ベッカー型筋ジストロフィーの原因となるジストロフィン遺伝子に加え、2つめのPLOD3遺伝子変異が存在することで、特に心筋のスティフネス（硬さ）に影響し、重症化に関わっていることが示唆されました。これら重症症例に対する今後の治療法開発につながると考えられます。

本研究成果は、2023年2月9日（木）（日本時間）に、米国科学誌「JACC: Basic to Translational Science」に公開されました。

タイトル：Modeling Reduced Contractility and Stiffness Using iPSC-Derived Cardiomyocytes Generated from Female Becker Muscular Dystrophy Carrier
著者名：Satoshi Kameda¹, Shuichiro Higo^1,2,*, Mikio Shiba³, Takumi Kondo¹, Junjun Li^4,5, Li Liu^4,5, Tomoka Tabata¹, Hiroyuki Inoue¹, Shota Okuno¹, Shou Ogawa¹, Yuki Kuramoto¹, Hideki Yasutake^1,6, Jong-Kook Lee^1,6, Seiji Takashima⁷, Yoshihiko Ikeda⁸, Shungo Hikoso¹, Shigeru Miyagawa⁴, Yasushi Sakata¹
1. 大阪大学大学院医学系研究科　循環器内科学
2. 大阪大学大学院医学系研究科　重症心不全内科治療学共同研究講座
3. 大阪警察病院　循環器内科
4. 大阪大学大学院医学系研究科　心臓血管外科学
5. 大阪大学大学院医学系研究科　組織再生デザイン学共同研究講座（研究当時、現在：最先端再生医療学共同研究講座）
6. 大阪大学大学院医学系研究科　先進心血管再生医学共同研究講座（研究当時、現在：心血管再生医学共同研究講座）
7. 大阪大学大学院生命機能研究科　医化学
8. 国立循環器病研究センター　病理部
*. 責任著者
ＤＯＩ：https://doi.org/10.1016/j.jacbts.2022.11.007

本研究は、日本学術振興会基盤研究C(19K08489、19K12801)、基盤研究B(21H02915)、挑戦的研究（萌芽）(20K21602、22K19526)、日本医療研究開発機構再生医療実現拠点ネットワークプログラム(21bm0804008h0005、22bm0804035h0001)の支援を受けて行われました。