大阪大学大学院歯学研究科口腔解剖学第一教室の大庭伸介教授（研究当時：東京大学大学院医学系研究科附属疾患生命工学センター准教授、長崎大学生命医科学域（歯学系）教授）、東京大学大学院医学系研究科外科学専攻感覚・運動機能医学講座の谷彰一郎研究員（日本学術振興会特別研究員）・田中栄教授、東京大学大学院医学系研究科附属疾患生命工学センターの北條宏徳准教授・鄭雄一教授、米国コネチカット大学のDavid W. Rowe教授をはじめとする国際共同研究グループは、ヒト多能性幹細胞から作製した骨組織を用いて骨発生過程に寄与する重要な転写因子群を解明しました。

主にマウスを用いた研究手法によって、骨発生過程において重要な複数の転写因子が明らかにされてきましたが、細胞種ごとに異なる転写因子同士の関係性やヒト骨組織での検証は今まで十分ではありませんでした。本研究グループは、ヒト多能性幹細胞を用いた骨発生過程の再現と次世代シークエンサー（next-generation sequencer: NGS）を用いたシングルセル解析（scRNA-seqおよびscATAC-seqを融合した最新のscMultiome解析）を駆使することで、ヒト骨発生過程における様々な転写因子の組み合わせ（転写制御ネットワーク）の一端を明らかにしました。本結果は、ヒト骨発生のメカニズムや骨系統疾患の病態理解への寄与と新たな治療標的の発見や治療戦略の確立へと発展することが期待されます。

本研究成果は、2023年3月24日午前11時（米国東部時間）に米国科学誌「Cell Reports」のオンライン版に掲載されました。

本研究の概略：ヒト多能性幹細胞由来骨組織の誘導、および骨発生における転写制御ネットワークと骨発生過程へのZEB2の関与の解明

運動や内分泌、造血など様々な機能を有する骨組織は、3つの異なる由来（神経堤、側板中胚葉、沿軸中胚葉）から２つの異なる過程（膜内骨化、軟骨内骨化）を経て形成されます。我々の骨格の多くは中胚葉が起源であり、まずは鋳型となる軟骨が一旦作られ、その後骨へと置き換わる（軟骨内骨化）ことで形成されます。この段階的な過程は、様々な細胞集団が特定の時期・場所ごとに機能することで成り立っていますが、その背景にあるメカニズムは完全には明らかになっていません。また、骨組織を構成する細胞（軟骨細胞や骨芽細胞）は共通の前駆細胞から分化することが知られているものの、細胞の運命が決定される仕組みは詳しくわかっていません。生体においてダイナミックに変化する細胞の状態（分化や機能）を理解するためには、その背景にある遺伝子発現とそれを制御する仕組みの理解が不可欠です。

同一個体内の細胞は、同一のゲノムDNA情報を共有していますが、そのDNA情報がどのように読み込まれ・書き出される（転写・翻訳）ことで機能を発揮するかは細胞毎に大きく異なり、これを制御する一つの機序が転写制御ネットワークになります。しかし、ヒトの骨発生過程における転写制御ネットワークについての理解は今まで不十分でした。加えて、骨組織に限らずヒトを対象とした研究領域では、倫理的な配慮が必要となります。そのため従来の研究では、主にマウスなどの実験動物を用いることで様々な知見が集積されてきました。しかしながら、実験動物で得られた知見をヒトへ応用する際の種差による再現性の問題も大きな課題です。一方で、近年iPS細胞に代表される多能性幹細胞は、無限の増殖能と多彩な分化能を背景に、様々な研究分野でヒト組織の構築や解析への応用が進んでいます。

本研究グループは、ヒト多能性幹細胞を用いて骨発生過程を再現し、その背景にある転写制御ネットワークの解明に取り組みました。骨組織を作製するために、多能性幹細胞から沿軸中胚葉（椎板）を2次元培養で誘導した後、誘導した細胞をマウス体内へ移植する２段階の工程を用いました。得られた骨組織に対して組織学的解析とシングルセル解析を用いることで、骨組織を構成する様々な細胞集団を同定し、同時に重要な転写因子群の探索を行いました。

本研究ではまず、既存の椎板誘導法を簡略化（異種成分不含、組換タンパク製剤不含）し、現状で最も短期間（５日間）かつ簡便な分化誘導法を確立しました。誘導した細胞を免疫不全マウスの腎被膜下へ移植することで、約1－2か月で軟骨組織が形成され、３－４か月で軟骨内骨化と同様の骨組織像が確認されました。また、骨軟骨部分はヒト由来、血球はマウス由来であり、移植した椎板が骨軟骨を形成し、マウスの血管や血球を呼び込むことで骨髄構造（骨化中心）を形成したことが示唆されました。

次に、細胞移植後７週と１９週の骨組織に対してscRNA-seq解析を行いました。その結果、軟骨内骨化過程における様々な細胞集団がヒト（骨軟骨）とマウス（血管・血球）の細胞で構成され、組織学的解析結果と矛盾しないことが示されました。さらに、ヒト胎児から取得された公共データとの統合解析を行い、我々が誘導した骨組織との類似性が示されました。以上のことから、多能性幹細胞由来の骨組織が、ヒト胎児期の骨発生過程を部分的に再現していることが示唆されました。

そこで、オープンクロマチンおよび遺伝子発現解析を組み合わせたシングルセル解析（scMultiome）を誘導した骨組織に行いました。まず、遺伝子発現パターンから、scRNA-seq解析と同様の各骨格系細胞集団が同定され、データの整合性が示されました。続いて、各細胞集団におけるオープンクロマチン領域と遺伝子発現の関係を確認したところ、細胞種に特異的なオープンクロマチンと遺伝子発現の相関性が示されました。つまり、細胞種特異的なクロマチン構造の変化によって、細胞種特異的な遺伝子発現が制御されていることが示唆されました。さらに、オープンクロマチン領域における各転写因子のモチーフ解析を行い、遺伝子発現とモチーフの集積状況から、各細胞集団における各転写因子の活性を推定しました。その結果、細胞種毎に異なる転写因子群（転写制御ネットワーク）が活性化していることが示され、細胞の運命決定や機能発現において、これら複数の転写因子の組み合わせが重要であることが示唆されました。

最後に、上記の方法ではカバーしきれない転写因子についても、遺伝子発現の変動（RNA velocity解析）と発現の程度（DEG解析）を掛け合わせることで、細胞の状態変化により寄与していると推定される転写因子候補を探索しました。得られた候補の大半は既知の因子であり、この手法の妥当性が支持された一方で、骨形成において機能が明らかでない転写因子ZEB2を同定しました。ZEB2は骨芽細胞においてマスター転写因子であるRUNX2やSP7と共発現し、ZEB2をノックダウン（発現抑制）もしくはノックアウト（発現欠失）することで、骨分化に関連する遺伝子の発現が低下すること、そしてマウス胎生期の頭部を中心とした骨形成障害が明らかとなりました。以上の結果から、ZEB2が骨形成において複数の遺伝子発現を制御している（転写制御ネットワークの一端を担っている）ことが示されました。また、ノックアウトマウスにおける表現型は、ZEB2の機能障害が原因として知られているMowat-Wilson症候群の頭部骨格異常と類似しており、骨芽細胞でのZEB2の機能不全がその一因である可能性も示唆されました。将来的な骨系統疾患における病態解明や新たな治療標的の発見についての一つの可能性を示したものと考えられます。

本研究では、ヒトの軟骨内骨化の再現、その過程における各骨格細胞の遺伝子発現およびオープンクロマチン領域情報の取得、運命決定や分化過程を制御しうる転写制御ネットワークの同定、が行われました。一連のNGSデータは公共データベースへ登録されております。また、本研究が世界で初めて、ヒト多能性幹細胞から作製した骨組織に対してscMultiome解析を応用しました。以上の結果は、ヒトの骨発生過程を研究するための貴重なリソースを提供するだけなく、細胞の状態に応じてダイナミックに変化する転写制御ネットワークの理解、そして正常な骨発生過程および骨系統疾患の機序解明や新規治療標的の発見に役立つ成果であると考えられます。

本研究成果は、2023年3月24日（金）午前11時（米国東部時間）に米国科学誌「Cell Reports」（オンライン）に掲載されました。

タイトル：“Stem-Cell-Based Modeling and Single-Cell Multiomics Reveal Gene Regulatory Mechanisms Underlying Human Skeletal Development”
著者名：Shoichiro Tani*, Hiroyuki Okada, Shoko Onodera, Ryota Chijimatsu, Masahide Seki, Yutaka Suzuki, Xiaonan Xin, David W. Rowe, Taku Saito, Sakae Tanaka, Ung-il Chung, Shinsuke Ohba*, and Hironori Hojo* （*共同責任著者）
DOI: 10.1016/j.celrep.2023.112276
URL: https://www.cell.com/cell-reports/fulltext/S2211-1247(23)00287-5

なお、本研究は、主に科研費「基盤(B)（課題番号：17H04403）」、「基盤(B)（課題番号：20H03885）」、「基盤(A)（課題番号：21H04952）」、AMED「再生医療実現拠点ネットワークプログラム（課題番号：JP21bm0704071）」の支援により実施されました。