学校法人関西医科大学（大阪府枚方市 理事長・山下敏夫、学長・友田幸一）医化学講座寿野良二講師、清水（小林）拓也教授らの研究チームは、京都大学医生物研究所杉田征彦特定助教、九州大学薬学部森本和志助教、大阪大学蛋白質研究所加藤貴之教授、髙﨑寛子助教、廣瀬未果特任研究員(常勤)らのグループと共同で、クライオ電子顕微鏡単粒子解析によってGタンパク質（G_i）結合状態の活性型プロスタグランジン受容体EP3の立体構造を決定しました。構造情報をもとにして、Gタンパク質と受容体が相互作用するアミノ酸について変異体を作製し、薬理学的解析によってシグナル伝達に重要なアミノ酸残基を明らかにしました。さらに、これまで決定されている他のプロスタグランジン受容体サブタイプ（EP2、EP4）とGタンパク質（G_s）の複合体構造と比較し、Gタンパク質と相互作用するがアミノ酸の種類が異なる部位に着目し、同様に変異体実験を行いました。その結果、Gタンパク質の種類によってシグナル伝達活性には特定のアミノ酸が必須であることを明らかにしました。

　薬剤ターゲットとして知られているGタンパク質共役受容体（以下「GPCR」）は様々なGタンパク質を活性化させてシグナルを伝達しますが、その選択性の詳細が近年のクライオ電子顕微鏡単粒子解析によるシグナル伝達複合体の解明によって少しずつ報告されるようになってきました。しかし、様々なGPCRのGタンパク質選択性の共通原理や全貌は明らかになっていませんでした。GPCRのGタンパク質の選択性の分子機構が明らかになれば、薬剤開発に有力な情報となります。

なお、研究結果をまとめた論文が米国科学誌「Cell Reports」（インパクトファクター：9.995）に9月13日（火）付（米国東部時間）で掲載されました。

• クライオ電子顕微鏡を用いて、炎症性発熱などに関与し、緑内障、高眼圧症治療薬のターゲットであるプロスタグランジン受容体EP3サブタイプとGタンパク質（G_i）結合状態のシグナル伝達複合体構造を可視化しました。
• 構造情報と薬理学的実験により、EP3のシグナル活性に重要なアミノ酸を明らかにしました。
• EP3と異なるGタンパク質（G_s）と他のプロスタグランジン受容体サブタイプ（EP2、EP4）とのシグナル伝達複合体構造と比較し、薬理学的実験と合わせて、Gタンパク質選択性に関わるアミノ酸を明らかにしました。

図1. プロスタグランジン受容体EP3シグナル伝達複合体の構造（PDB ID: 7WU9を一部改変）とGタンパク質選択性に関わるアミノ酸

プロスタグランジン受容体はGPCRファミリーに属し、プロスタグランジンPGE2と結合するサブタイプは4種類あります（EP1、EP2、EP3、EP4）。GPCRは大きく分けて4種類のGタンパク質（G_i/o、G_s、G_q/11、G_12/13)と共役し、EP1はG_q/11、EP2/EP4はG_s、EP3はG_i/oと共役します。

今回、寿野講師、小林教授らの研究チームは、クライオ電子顕微鏡による単粒子解析法によりプロスタグランジン受容体EP3とGタンパク質（G_i）ヘテロ三量体からなるシグナル伝達複合体の3次元構造を解明しました（図1左および中央）。構造情報をもとにしてEP3とGタンパク質の相互作用部位が明らかになり、相互作用する部位のアミノ酸変異体について薬理学的解析を行うことで、EP3のシグナル伝達に重要な部位を解明しました。また、G_sと共役するプロスタグランジン受容体サブタイプのEP2およびEP4のシグナル伝達複合体構造とEP3シグナル伝達複合体構造を比較し、対応するアミノ酸の置換変異体について薬理学的解析を行い、Gタンパク質特異的に重要なアミノ酸とその部位を見出しました（図１右）。EP2、EP3、EP4と同様に、サブタイプによってG_i/oまたはG_sと異なるGタンパク質に共役する他のGPCRとしてドーパミン受容体があり、そのシグナル伝達複合体でも同じ位置のアミノ酸がGタンパク質と相互作用していました。このアミノ酸によるGタンパク質選択性は様々なGPCRにも共通している可能性があることが示唆されました。

GPCRは神経伝達物質やホルモンなどの様々なリガンドと結合して活性化すると、細胞内の様々なシグナル伝達因子を活性化することでシグナルを伝達しています。GPCRは多様な生命現象に関わっているとともに病気にも関与しており、薬剤ターゲットとして知られています。GPCRの立体構造を決定すると、リガンドの結合様式やGPCRのシグナル伝達機構を理解することができ、この情報をもとにして、より高親和性、高選択性のリガンド開発に重要な情報を提供することができます。つまり、GPCRの活性化を抑制するリガンド（拮抗薬）やGPCRを活性化するリガンド（作動薬）、シグナル選択的なリガンド（バイアス型リガンド）などの薬剤開発に大きく近づけることができます。近年のクライオ電子顕微鏡単粒子解析（Cryo-EM SPA)の高分解能化によって時間や労力が膨大に必要であったGPCRの構造解析のスピードが大きく加速したこともあり、様々な立体構造を比較することが可能になってきました。

本研究の要点はプロスタグランジン受容体-Gタンパク質複合体の構造比較と薬理学的解析によって、２つのGタンパク質シグナル選択性に重要なアミノ酸を明らかにしたことです。具体的には、第5膜貫通領域（TM5）の5.68（BW番号）と第2細胞内ループ（ICL2)の34.51です。5.68の位置はEP3では259番目のアルギニン残基（R259）で、アルギニン残基の側鎖がG_iの340番目のスレオニン残基（T340）の側鎖と水素結合していました（図2）。EP4では対応するアミノ酸は213番目のメチオニン残基（M213）でした。M213はG_sの384、385番目のグルタミン、アルギニン残基（Q384、R385）と相互作用します（図2B）。EP4においてM213をアルギニンに置換した変異体M213Rは、EP4のG_sシグナル活性を大きく減少しました。この理由として、構造情報を見ると5.68の位置にアルギニン残基があるとその側鎖が特にR385の側鎖と立体障害や正の電荷の反発などが生じる可能性があります。このことから5.68の位置がアルギニン残基の受容体はG_sシグナルを示さず、G_iシグナル活性は示せることが示唆されました（図2）。34.51の位置のアミノ酸は、G_iと共役するEP3ではヒスチジン残基であり、G_sと共役するEP2、EP4ではチロシン残基でした（図3B）。EP3の34.51をチロシン残基にした変異体は本来示さないG_sシグナル活性を示したことから、この位置のアミノ酸がG_s共役に重要であることが示唆されました。このことはすでにマウスのEP3の実験で報告されていましたが、今回ヒトEP3において構造情報と薬理学的実験によってさらに詳細に理解することができました。34.51の芳香族アミノ酸の側鎖とG_sの41番目のヒスチジン残基（H41）や376番目のフェニルアラニン残基（F376）の側鎖の相互作用がG_sシグナル活性に必要であることが構造情報からも明らかとなりました(図3)。

これらのGタンパク質選択性に重要なアミノ酸残基が他のGPCRにも同様の効果があるかどうかをドーパミン受容体-Gタンパク質複合体の構造情報で検討し、プロスタグランジン受容体と類似した傾向にあることがわかりました。今回我々が見出した２つのGタンパク質選択性に重要なアミノ酸は他のGPCRでも共通した役割を担っていると考えられ、Gタンパク質のシグナル伝達機構について新たな分子機構があることを示しました。

図2. Gタンパク質と相互作用する第5膜貫通領域の5.68の位置のアミノ酸の比較
A. EP3-G_i複合体（PDB ID: ７WU9）、EP3（グレー）、G_i（オレンジ）、B. EP4-G_s複合体（PDB ID: 7D7M）、EP4（グリーン）、C. EP2-G_s複合体（PDB ID: 7CX2）、EP2（ブルー）、G_s（イエロー）

図3. Gタンパク質と相互作用する第2細胞内ループの34.51の位置のアミノ酸の比較
A. EP3-G_i複合体（PDB ID: 7WU9）、EP3（グレー）、G_i（オレンジ）、B. EP4-G_s複合体（PDB ID: 7D7M）、EP4（グリーン）、EP2-G_s複合体（PDB ID: 7CX2）、EP2（ブルー）、G_s（イエロー）

本研究ではプロスタグランジン受容体のGタンパク質選択性について、2つのアミノ酸が関与していることを証明しましたが、EP3は選択的スプライシングに由来するアイソフォームが存在し、それらはG_i/o以外のGタンパク質と共役することが知られています。その特徴としてはC末端の配列のみが異なるという点で、今回見出したアミノ酸とは全く異なる機構でのGタンパク質選択性の分子メカニズムが存在することが予想されます。具体的にはアイソフォームはEP3A、３B、３C、３Dなどが知られており、３AはG_i/o、３Bと３CはG_s、３DはG_q/11といったように結合するGタンパク質が異なるので、これらの複合体構造を決定することによってEP3独自のGタンパク質選択性のメカニズムが解明されることが期待されます。また、EP3はG_12/13とも共役するので、それらの複合体構造を決定することによってEP3のG_i/oとのシグナル伝達機構の相違点が明らかになるとともに構造情報をもとにしてサブタイプ選択的なGタンパク質活性化を示す創薬への応用が期待されます。