大阪大学大学院連合小児発達学研究科の岡雄一郎講師、佐藤真教授（両名とも医学系研究科　神経機能形態学（兼任））らの研究グループは、大脳皮質内において、異なる頭葉間の離れた領野をつなぐ神経回路のでき方を明らかにしました。

大脳皮質は、運動や体性感覚など、機能によって異なるさまざまな領野（機能領野）があり、各領野の間は直接の神経回路(連合回路)で連絡しています。連合回路の中でも特に同側の異なる頭葉にある領野の間を結ぶ長距離の回路を長連合回路と言い、異なる感覚を統合したり、意思に基づいて運動を制御したりといった大脳皮質の高次機能に重要と考えられています。しかしながら、研究ツールとなるマーカーも知られておらず、長連合回路の細胞レベルでの構造や回路形成の過程は、よくわかっていませんでした。

今回、研究グループは、マウス大脳皮質の頭頂葉の１次体性感覚野から前頭葉の１次運動野に投射する神経細胞に着目し、その軸索の伸長過程を解析しました。その際、長連合回路を作る神経細胞(長連合ニューロン)に選択的なマーカーを駆使して蛍光タンパク質GFPを発現させて、１つ１つの細胞レベルで可視化し、生後の発達段階での軸索の様子を調べました。１次体性感覚野の長連合ニューロンは初め、反対側の大脳皮質に軸索を伸ばしますが、生後３日目に大脳皮質内で軸索側枝を出すこと、そのうちで１番長い軸索側枝が１次運動野に伸びることを明らかにしました(図1)。

本研究で、大脳皮質の頭葉間の神経回路は反対側も含めたより広範なネットワークをもつことが明らかになり、これにより、脳の高次機能を担う神経回路ができる仕組みの解明や、回路の進化の過程の理解につながると期待されます。

本研究成果は、米国科学誌「Cerebral Cortex」(電子版)に７月６日（火）に掲載されました。

図1. 大脳皮質の長連合回路のでき方 大脳皮質の１次体性感覚野(青)から１次運動野(橙)への長連合回路(赤矢印)は反対側へ伸びる脳梁線維から出芽する軸索側枝の中で一番早く伸びる側枝として形成される。

脳は情報の種類によって処理する場所を分け、処理済みの情報を別の場所に持ち寄って比較したり統合したりという一段高いレベルの処理を行います。そのため、大脳皮質には扱う情報が異なる多くの機能領野が存在します。ある領野で処理された情報を別の領野に送るため、領野と領野をつなぐ神経回路がありこれを連合回路と言います。さらに、大脳皮質にはより大きな区分けである頭葉があり、異なる頭葉にある２つの領野をつなぐ回路を長連合回路と言います。例えば、頭頂葉の１次体性感覚野（皮膚からの触覚情報を受け取る）から前頭葉の１次運動野（脊髄に運動の指令を送る）には直接の神経回路があります。長連合回路は異なる感覚情報を統合したり、感覚情報や記憶などの内部情報に基づいて判断したり、意志による運動制御を行ったりするのに重要であると考えられています。また、１次体性感覚野から１次運動野への長連合回路の形成不全は器用な動きが苦手という症状(発達性協調運動障がいの一種)と関連することが報告されています。しかし、発達の過程で大脳皮質の領野間、特に頭葉間の長連合回路がどのように作られるのかはほとんどわかっていませんでした。長連合回路を調べるためのツールとなるマーカー分子も知られていませんでした。

研究グループは、まずマウス大脳皮質において、１次体性感覚野から１次運動野への長連合回路がどのような構造になっているか調べるため、１次運動野に逆行性の神経トレーサーを注入し、１次体性感覚野から１次運動野に軸索を伸ばして回路を作っている長連合ニューロンの分布を調べました。その結果、6層ある大脳皮質の層構造のなかで、１次体性感覚野の３つの層にバンド状に分布する細胞が１次運動野に軸索を伸ばすことがわかりました（図２A、C左）。そこで、この長連合ニューロンのマーカーとなる分子を探すため、同じような層分布を示すPlxnd1遺伝子に着目し、神経トレーサーで染まる細胞の80％がPlxnd1を発現することがわかりました（図2B、C、D）。

次に、子宮内電気穿孔法を用いて、マウス胎児の脳にPlxnd1遺伝子が発現している細胞において蛍光タンパク質GFPが発現するような遺伝子を導入することで、少数の長連合ニューロンで蛍光タンパク質ＧＦＰを発現させる手法を確立しました。生後の発達段階で脳組織を取り出し、大脳皮質部分だけを剥がしとってカバーガラスの間に挟んで平板にし、その状態で組織透明化を行いました(図３A)。これにより、薄切り切片を作製しなくても、蛍光を発する長連合ニューロンの軸索の全体構造を個々のニューロンごとに解析することが可能となりました。そこで、まず生後７日目で観察してみると、個々の長連合ニューロンは１次運動野に軸索を伸ばすだけでなく、左右の大脳皮質をつなぐ軸索線維である脳梁線維も伸ばすdual-projectionニューロンであることがわかりました。脳梁線維の軸索は大脳皮質の直下で軸索がたくさん集まっている白質と呼ばれる領域を通って反対側にまで伸びているのに対し、１次運動野に伸びるもう一方の軸索は大脳皮質内で起こっているたくさんの枝分かれのうちの１番長いもので白質は通らないことがわかりました。また、1次運動野に至るまでの間にはほとんど枝分かれもありませんでした(図３B)。

そこで次に、１次運動野に伸びる軸索が発達段階でどのように伸びるのか調べたところ、生後すぐには脳梁線維の軸索のみが伸びているのに対し、生後３日目に大脳皮質内で枝分かれが起き始める（軸索側枝の出芽が始まる）こと、１次運動野に伸びる軸索側枝は調べたどの発達段階でも他の軸索側枝よりも長く、その長さの差は次第に大きくなることがわかりました（図4）。

以上の結果から、頭葉間を結ぶ長連合回路は、左右の大脳皮質をつなぐ脳梁線維の軸索の側枝として形成されること、その伸長スピードは同時期に出芽した軸索側枝と比べて早いことがわかりました。　

図2. Plxnd1遺伝子は１次体性感覚野から１次運動野へ投射する長連合ニューロンの8割で発現 (A)大脳皮質の１次運動野に注入した逆行性の神経トレーサーで染色された長連合ニューロンの１次体性感覚野での分布。左下図は注入部位（矢印）と切片の切断位置(点線)を示す。
(B)大脳皮質の１次体性感覚野を通る切片でのPlxnd1の発現分布(青紫)。
(C)トレーサーで染色された１次体性感覚野の長連合ニューロン(緑)とPlxnd1発現細胞(青紫)の分布の比較。どちらも2/3層（L2/3）と5a層（L5a）に分布している。
(D)逆行性トレーサー（濃緑）とPlxnd1(橙)の２重染色(左の２つの写真)。両方で染色された細胞(白矢頭)はトレーサーで染色された細胞の8割を占めた(右グラフ)。

図3. 単一長連合ニューロンの軸索構造の可視化 (A)脳組織を摘出後、大脳皮質を剥がして平板化し、さらに組織を透明化した様子。
(B)生後7日目にGFPの蛍光でラベルされた長連合ニューロンを観察し、軸索をトレースした4例を示す。１次体性感覚野から１次運動野に伸びる軸索(青矢印)に加え、反対側へと伸びる脳梁線維の軸索(赤矢印)も併せ持つdual-projectionニューロンであることが明らかになった。

図4. 長連合回路の軸索側枝は他の軸索側枝よりも早く伸びる (A)長連合ニューロンの１次運動野への軸索は生後3日目（P3）に出芽した中で最長の軸索側枝であり、それ以外の軸索側枝はP7でも細胞体(赤)のある１次運動野内かその近傍までしか伸びなかった。
(B)軸索側枝の長さの定量データ。各細胞において、最長の軸索側枝の長さとそれ以外の軸索側枝の平均長の差は発達が進むにつれて大きくなっていた。

本研究成果により、大脳皮質の頭葉間の離れた領野をつなぐ神経回路のでき方が明らかになりました。１次体性感覚野から１次運動野への長連合回路の形成不全は器用な動きが苦手という症状(発達性協調運動障がいの一種)と関連することが指摘されており、これらの疾患(群)における回路形成不全の実態解明と、それに基づく治療法の開発への展開につながることが期待されます。また、長連合回路を作る長連合ニューロンは、脳梁線維と長連合回路の双方の軸索を持つdual-projectionニューロンであることが明らかになりました。dual-projectionニューロンはマウスだけでなく、ヒトを含む霊長類でも見つかっており、発達期の脳の標準的な回路単位の１つと考えられます。その発達過程で長連合回路が脳梁線維の軸索から出芽する軸索側枝として形成されるという現象は、動物種を超えて保存されている共通のメカニズムである可能性があります。dual-projectionは単に２つの領野をつなぐだけでなく反対側の大脳皮質との連絡もあることから、大脳皮質の高次機能を担う広範なネットワークの形成機構の理解に資するものと言えます。