大阪大学大学院工学研究科の安本周平助教、村中俊哉教授の研究グループは、ハイスループットシークエンス(次世代シークエンス、NGS)技術を使用することで、ゲノム編集ジャガイモ中の外来核酸を検出できることを示しました。これにより、外来DNAの残存しないゲノム編集ジャガイモを選抜することが可能な、ゲノム編集ジャガイモ中の外来DNA検出法が新たに加わることとなります。

これまでにゲノム編集ジャガイモ中の外来DNAの検出法としては、PCR法、サザンハイブリダイゼーション法などが知られていましたが、数十塩基程度の短い DNA 断片を網羅的に解析する面での課題がありました。

今回、安本助教らの研究グループは、農研機構の研究者らが開発した k-mer 法を使用することで、ゲノム編集ジャガイモ中の短い外来DNAを検出することに成功しました。これにより、外来遺伝子の残存しないゲノム編集ジャガイモを選抜することが可能な検出法が加わり、ゲノム編集技術を用いたジャガイモの開発・育種が加速することが期待されます。

本研究成果は、国際科学誌「Scientific Reports」に、８月９日（水）１８時（日本時間）に公開されました。

図1. ゲノム編集したジャガイモのサンプルにおいて、用いたベクター配列上の各位置（横軸）で検出されたk-mer の数とG検定の結果。1%水準で有意な k-mer は赤色で示す。

ゲノム編集は生物に新たな形質を高効率に付与できる強力な手法です。農作物においても、従来の育種技術では作出が難しい新たな系統を作出することが期待されています。これまでに、大阪大学大学院工学研究科などの研究グループは生合成酵素遺伝子をゲノム編集によって破壊することで、有毒なステロイドグリコアルカロイド (SGA) を低減させたジャガイモを開発しています。日本国内では、外来核酸(DNA)の残存しないゲノム編集生物は、必要な情報を主務官庁へ届け出ることで、拡散防止措置をとることなく、ゲノム編集生物を使用することができます。ゲノム編集ジャガイモにおいて外来DNAを検出するための手法として、これまでは PCR 法やサザンハイブリダイゼーション法が用いられていました。これらの手法は外来DNAを高精度に検出できる一方、短い外来DNAを網羅的に確認する面での課題がありました。農研機構の研究者らによって開発された k-mer 法は、ハイスループットシークエンス技術を使用して取得した大量の全ゲノム配列データから、ゲノム編集に使用したプラスミドの断片配列と同一の配列をカウントし、野生型のデータと比較することで、ゲノム編集生物中に含まれる外来DNAを検出します。k-mer 法のジャガイモへの応用は報告されていませんでした。

安本助教らの研究グループは、ジャガイモ中の外来遺伝子の検出にk-mer 法が適用可能かを明らかとするために、コンピューターシミュレーションによる解析を実施しました。これは、20塩基の外来DNAが挿入された四倍体のジャガイモゲノム情報をコンピューター上で作成し、NGSデータのシミュレーション、k-mer 解析を実施することで行われました。その結果、ジャガイモゲノムの30倍以上のデータ量を使用することで、20塩基という短い外来DNAを 100% の確率で検出できることが明らかとなりました。

次に、先行研究で作成されたゲノム編集ジャガイモから取得したゲノム DNA から実際に NGS データを取得し、k-mer 法による外来DNAの検出を試みました。その結果、ポジティブコントロールである外来遺伝子を持つゲノム編集ジャガイモ系統中の外来遺伝子の検出に成功しました (図１)。興味深いことに、１つのゲノム編集系統ではゲノム編集に使用したプラスミド DNA 上の配列が断片的に検出されました。そのうちの 150 塩基対の短い断片について PCR 法による確認を実施したところ、その系統特異的に外来 DNA の増幅が検出されたことから、k-mer 法によっても、ゲノム編集ジャガイモ中の外来遺伝子を検出することが可能であることが明らかになりました。

SDGs への貢献が期待できることから、ゲノム編集を用いたジャガイモの育種は世界的にも大きな関心が寄せられています。これまでに利用されてきた PCR 法やサザンハイブリダイゼーション法に加えて新たに k-mer法が外来DNAの検出に利用可能となり、残存性の評価が可能となります。それによって、ジャガイモ育種におけるゲノム編集技術の普及が期待できます。

本研究成果は、2023年８月９日（水）１８時（日本時間）に国際科学誌「Scientific Reports」（オンライン）に掲載されました。

タイトル：“Foreign DNA detection in genome-edited potatoes by high-throughput sequencing”
著者名：Shuhei Yasumoto and Toshiya Muranaka
ＤＯＩ：https://doi.org/10.1038/s41598-023-38897-x

なお、本研究は、農林水産省委託プロジェクト研究・ゲノム編集技術を活用した農作物品種・育種素材の開発（国民理解促進のための科学的知見の集積）の一環として行われました。また、本研究で実施したコンピューターシミュレーションの一部は情報・システム研究機構 国立遺伝学研究所が有する遺伝研スーパーコンピュータシステムを利用しました。

なお、本研究論文では20塩基までの外来DNA検出が可能であるとしましたが、これはゲノム編集生物の規制対象に20塩基までの検出を行うべきと主張するものではなく、あくまでも、一定の条件下での技術的限界を検討した結果です。また、本研究で使用したゲノム編集ジャガイモは、現在野外栽培試験を実施している系統とは異なるものです。

安本 周平 助教
研究者総覧 https://rd.iai.osaka-u.ac.jp/ja/87a5383a396381c9.html
所属研究室HP http://www.bio.eng.osaka-u.ac.jp/pl/index.html