橋本 里菜 研究員（CiRA増殖分化機構研究部門）、高橋 潤也 大学院生（大阪大学大学院薬学研究科 臨床薬効解析学分野）、高山 和雄 講師（CiRA同部門）、岡田 欣晃 准教授（大阪大学同分野）らの研究グループは、新型コロナウイルス（SARS-CoV-2）が、血管内皮細胞間の密着結合に関わるClaudin-5（CLDN5）の発現を抑制することで血管内皮バリアを破壊し、血管内へと侵入することを明らかにしました。

SARS-CoV-2は、呼吸器上皮細胞に感染したのち、血管を介して他の臓器に伝播します。このとき、SARS-CoV-2は呼吸器から血管の壁（血管内皮細胞のバリア）をこえて血管内に侵入しますが、そのメカニズムは不明でした。研究グループは、気道上皮細胞と血管内皮細胞で構成された気道チップを使用して、SARS-CoV-2が血管内皮細胞間の密着結合に関わるCLDN5の発現を抑制し、Vascular endothelial-cadherin（VE-cadherin）による血管内皮細胞間の接着結合を減弱させることで、血管内皮バリアを破壊することを見出しました。実際、新型コロナウイルス感染症（COVID-19） 患者さんの肺においてCLDN5の遺伝子およびタンパク質発現量が減少していることを確認しました。また、血管内皮細胞のCLDN5の発現量を、遺伝子導入や低分子薬（フルバスタチン）で増加させることで、SARS-CoV-2による血管内皮バリア破壊を抑止することができました。これらの結果から、CLDN5の発現抑制は、SARS-CoV-2による血管内皮バリア破壊による呼吸器病態の進展と重症化に重要なメカニズムであり、CLDN5の発現促進がCOVID-19の新しい治療戦略となることが示されました。また、COVID-19 患者さんの呼吸器病態の再現と治療薬の探索ができる気道チップ技術は、今後COVID-19を含む重症呼吸器感染症の病態解明と治療薬開発のための優れたツールとなることが期待されます。

この研究成果は2022年9月22日（日本時間）に「Science Advances」でオンライン公開されました。

血管内皮細胞はSARS-CoV-2感染受容体であるアンジオテンシン変換酵素2（ACE2）の発現量が少ないため、SARS-CoV-2にほとんど感染しません。しかし、COVID-19患者さんでは、血管炎や血管内皮バリア破壊が観察されます。血管内皮バリアが破壊されると、SARS-CoV-2が血管を介して、呼吸器から他臓器へ移動するのを促進するだけでなく、肺の血管外への免疫細胞や血液成分の浸潤を促し、肺炎や急性呼吸窮迫症候群（ARDS）などの重症病態を誘発します。SARS-CoV-2による血管内皮バリア破壊は、COVID-19患者さんにおいて阻止すべき重大な問題ですが、そのメカニズムはほとんど解明されていません。

本研究では、SARS-CoV-2に感染させた気道チップのヒト肺血管内皮細胞（HMVEC-L）の包括的な遺伝子発現を解析し、SARS-CoV-2による血管内皮バリア破壊に寄与する遺伝子としてCLDN5を特定しました。さらに、CLDN5の機能解析を進めるとともに、CLDN5がCOVID-19の創薬ターゲットになりうるか検討しました。

１）気道チップによるSARS-CoV-2による血管内皮バリア破壊の再現
SARS-CoV-2による血管内皮バリアの破壊および呼吸器から血管への移行を模倣するために、気道チップを使用しました。気道チップは、気道上皮細胞（線毛細胞、クラブ細胞、杯細胞、基底細胞）とHMVEC-Lで構成され、気道チャネルおよび血管チャネルにそれぞれ空気および培地を流すことにより、気道における微小環境を再現できます（図1A）。気道チャネルにおけるウイルスゲノム量は感染4日目にピークに達する一方で、血管チャネルでは3日目に増加し始め感染7 日目でピークに達しました（図1B）。以上のように気道チップを用いることにより、SARS-CoV-2が気道から血管へ漏出する様子を再現することに成功しました。

図1. 気道チップを用いたSARS-CoV-2による血管内皮バリア破壊の再現
(A) 気道チップの概略図。SARS-CoV-2を気道チャネルに感染させ8日間解析した。 (B) 気道および血管チャネルにおけるウイルスゲノム量の経時変化

２）SARS-CoV-2による血管内皮バリア破壊の原因遺伝子の探索
遺伝子発現を包括的に調べたところ、感染した気道チップのHMVEC-Lにおいては、細胞接着関連遺伝子発現が減少していました。特定した細胞接着関連遺伝子のうち、CLDN3、CLDN5、PCDHB1、PCDHB8、IGSF9Bの遺伝子発現が顕著に減少していました（図2A）。さらに、これらのうち、CLDN5の内因性遺伝子発現量が最も高いことが示されました（図2B）。以上のことから、CLDN5はSARS-CoV-2による血管内皮バリア破壊の原因遺伝子である可能性が示唆されました。

図2. SARS-CoV-2による血管内皮バリア破壊の原因遺伝子の探索
(A) 特定した細胞接着関連遺伝子遺伝子のうち、減少が顕著な上位5つの遺伝子 *:p <0.05の有意差を示す。 (B)非感染HMVEC-Lにおける内因性遺伝子発現量が高い上位7つの遺伝子

３）SARS-CoV-2は気道チップ上のHMVEC-LにおけるCLDN5の発現を抑制する
感染した気道チップ上のHMVEC-L間の結合部でのCLDN5タンパク質の減少も観察されました（図3）。VE-cadherinタンパク質の発現量は感染により変化しませんでしたが、接着結合が破壊され、細胞間に隙間が確認されました。以上のことから、SARS-CoV-2がHMVEC-LにおいてCLDN5の発現を抑制し、VE-cadherinの局在を変化させることで、血管内皮バリアを破壊することが示されました。

図3：気道チップのHMVEC-LにおけるCLDN5とVE-cadherin発現解析
非感染、感染時のHMVEC-LにおけるCLDN5およびVE-cadherinタンパク質の局在 **:p <0.01の有意差を示す。

４）CLDN5の過剰発現がSARS-CoV-2による血管内皮バリア破壊を抑止した
ドキシサイクリン（DOX）作用により、CLDN5の発現量が上昇するHMVEC-Lを作製しました（図4A）。CLDN5の過剰発現は、SARS-CoV-2の血管チャネルへの侵入およびVE-cadherinを介した細胞間接着の減弱を防止しました（図4B, 4C）。以上の結果から、HMVEC-LにおけるCLDN5の過剰発現が、SARS-CoV-2による血管内皮バリア破壊を抑止することが示されました。

図4. CLDN5過剰発現HMVEC-Lを用いたSARS-CoV-2感染実験
(A) CLDN5発現誘導可能なHMVEC-L にDOXを作用させた際のCLDN5の遺伝子発現量 (B) DOX作用による気道および血管チャネル中のウイルスゲノム量の変化 (C) DOX作用によるVE-cadherinの局在変化 *:p <0.05, **:p <0.01の有意差を示す。

５）フルバスタチン誘導性のCLDN5の発現上昇がSARS-CoV-2による血管内皮バリア破壊を抑止した
スタチン治療によりCOVID-19 患者さんの死亡率が低下することが報告されています。スタチンの一種であるシンバスタチンは、肺動脈内皮細胞におけるCLDN5発現を増加させることにより急性肺損傷を軽減することも報告されています。

本研究では、HMVEC-Lにフルバスタチンを作用させたところ、CLDN5の遺伝子発現量を増加できることを確認しました（図5A）。また、SARS-CoV-2の血管チャネルへの侵入およびVE-cadherinを介した細胞間接着の減弱を部分的に防止しました（図5B, 5C）。以上の結果から、フルバスタチンはCLDN5の発現を増加させ、SARS-CoV-2による血管内皮バリア破壊を抑止することが示唆されました。

図5. フルバスタチンを作用させたHMVEC-Lを用いたSARS-CoV-2感染実験
(A) フルバスタチン作用時のHMVEC-LにおけるCLDN5、VE-cadherin遺伝子発現量 (B) フルバスタチン作用による気道および血管チャネル中のウイルスゲノム量の変化 (C) フルバスタチン作用によるVE-cadherinの局在変化 *:p <0.05, **:p <0.01の有意差を示す。

６）COVID-19 患者さんにおけるCLDN5発現
COVID-19とCLDN5の関係を調べるために、健常人およびCOVID-19 患者さんの肺の検体を用いてCLDN5の発現を解析しました。COVID-19 患者さんの肺において、CLDN5の遺伝子発現量が低下していました。また、CLDN5タンパク質がほとんど消失していしました（図6A）。さらに、重症度の異なるCOVID-19 患者さんの血清中のCLDN5濃度を測定したところ、重症患者さんの血清CLDN5濃度（180 pg / mL）は、軽症・中等症患者の血清CLDN5濃度（484 pg / mL）よりも低いことが分かりました。（図6B）。CLDN5の主な供給源は血管内皮細胞であるため、血清中のCLDN5の量は、血管内皮細胞におけるCLDN5の発現量と相関していると考えられます。以上のことから、CLDN5の発現低下は、感染した気道チップだけでなく、COVID-19 患者さんの肺においても確認できました。

図6. COVID-19 患者さん肺の検体を用いた解析
(A) 健常人とCOVID-19患者の肺切片のCLDN5の免疫染色画像 (B) 軽症/中等症、重症のCOVID-19患者血清中のCLDN5濃度比較（ELISA）*:p <0.05の有意差を示す。

本研究では、気道チップを用いて、SARS-CoV-2感染が血管内皮細胞におけるCLDN5の発現を抑制することで、血管内皮バリア破壊を誘発することを発見しました。この現象はCOVID-19患者さんの肺でも確認することができました。また、CLDN5の過剰発現とフルバスタチンの作用により、SARS-CoV-2によるバリア破綻を抑制できることを明らかにしました。以上の研究を通して、呼吸器におけるSARS-CoV-2による血管内皮バリア破壊のメカニズムを発見し、COVID-19に対する新しい治療戦略を提案しました。