大阪大学大学院医学系研究科の大学院生の橘優汰さん（博士後期課程）、大阪大学微生物病研究所の山本雅裕教授（免疫学フロンティア研究センター、感染症総合教育研究拠点兼任）らの研究グループは、生体内CRISPRスクリーニング技術を駆使して、病原性寄生虫「トキソプラズマ原虫」の病原性発揮に必須の遺伝子を多数同定しました。

トキソプラズマ原虫は寄生虫の一種で新生児や免疫不全患者に致死的な感染症を引き起こします。トキソプラズマ原虫のタンパク質は細胞内の特定の場所に存在することでその機能を発揮します。これまでに世界中で多くの研究が行われてきたにもかかわらず、トキソプラズマ原虫の遺伝子がコードする約8000個のタンパク質の多くは細胞内の局在および機能が依然として不明なままであり、病原性への関与も未知数な状態でした。こういった局在や機能が未知の遺伝子群の存在はトキソプラズマ症の病態解明において大きな障壁となっていました。

今回、研究グループは、以前に同グループが樹立した生体内CRISPRスクリーニング技術を駆使することで、細胞内局在が不明であった約600個のトキソプラズマ遺伝子をマウスの生体内で網羅的にスクリーニングし、トキソプラズマ原虫の病原性を発現するために必須の因子を多数同定することに成功しました。その中でも医学的に最も重要な寄生虫のグループである『アピコンプレクサ』に共通しているRimM遺伝子に着目し、それがトキソプラズマ原虫の生存に必須であることを証明しました（図1）。本研究成果によりアピコンプレクサが引き起こすトキソプラズマ症やマラリアの病態解明、ひいては新規治療薬やワクチン開発につながることが期待されます。

本研究成果は、米国科学誌「mBio」に、7月31日（水）に公開されました。

図1. 本研究の概念図

寄生虫は宿主（ヒトや動物など）に寄生して、時に恐ろしい病気（感染症）を引き起こします。寄生虫の中でも、アピコンプレクサと呼ばれるグループは世界中でヒトに病気を起こす医学的に最も重要な寄生虫です。このアピコンプレクサの中には、発展途上国で猛威を振るうマラリア原虫や、先進国においても新生児や免疫不全患者に致死的疾患を起こすトキソプラズマ原虫が含まれています。その中でもトキソプラズマ症の原因となるトキソプラズマ原虫は全世界で人口の約３分の１が感染していると考えられていて、ネコの糞や汚染された食べ物などから感染します。トキソプラズマ原虫は8000個以上の遺伝子を持っていますが、その多くが機能不明であり、どの遺伝子がヒトに病気を起こすのに重要なのかはよくわかっていません。

近年、遺伝子を操作する技術であるCRISPR（クリスパー）/Cas9ゲノム編集を応用することで、寄生虫が病気を引き起こすのに重要な遺伝子をまとめて見つけることを可能とする生体内CRISPRスクリーニング法が開発されました。この革新的技術によって、寄生虫の病原性遺伝子の研究は飛躍的に進みました。山本教授らのグループを含め世界中の研究チームが激しい競争の中でCRISPRスクリーニング技術を活用した研究を行っており、トキソプラズマ原虫が病気を起こすのに重要な遺伝子をこれまでに多数発見してきました。

寄生虫が産生するタンパク質は細胞内の決まった場所（細胞内小器官）に位置することでその効果を発揮します。特にトキソプラズマ原虫に代表されるアピコンプレクサは宿主の細胞内に寄生することに特化して進化したため、我々ヒトの細胞には存在しない特殊な分泌器官（マイクロネーム、ロプトリー、デンスグラニュール）や植物の持つ葉緑体に類似した色素体（アピコプラスト）を有しています。そのため病原性タンパク質の特性を明らかにするためには、そのタンパク質が寄生虫の細胞内のどこに位置しているのかを知ることが大きな手がかりとなります。以前に行われた研究による大規模な解析によって約2000種類のタンパク質の細胞内での位置が高精度に予測されました。しかし、依然として大部分のタンパク質に関しては細胞内のどこに位置していて、何をしているのか、寄生虫が病気を引き起こすのに重要なのかはわかっていませんでした。

研究グループは、細胞内での位置が不明であった遺伝子約600個に対して生体内CRISPRスクリーニングを行うことで、トキソプラズマ原虫が宿主の身体の中に適応して病気を起こすのに重要なタンパク質を多数見つけ出すことに成功しました。

さらに、その中でも寄生虫の中で最も医学的に重要なアピコンプレクサが共通して持っている遺伝子であるTgGTPaseとTgRimMという2つの遺伝子に注目して詳しい解析を行いました。その結果、特にTgRimMタンパク質はアピコプラストと呼ばれる葉緑体に類似した色素体に位置していることがわかりました（図2）。このアピコプラストはかつて葉緑体であったと考えられており、現在は光合成を行う能力を喪失しているものの、今でも寄生虫の成長に必須の栄養素を作り出しています。遺伝子操作によってTgRimMを欠損したトキソプラズマは、成長に障害がありマウスに病気を起こすことができなくなっていました。TgRimMを詳しく調べるとジンクフィンガーと呼ばれる部位があり、このジンクフィンガーを欠損したTgRimM変異体は正常に機能しなくなることがわかりました。大腸菌やシロイヌナズナの持つRimMタンパク質はRNAと呼ばれる物質の調節に働くと報告されています。そのため、トキソプラズマのアピコプラストの中でもTgRimMがRNAを調節している可能性が示唆されました。また、同じくアピコンプレクサに属する寄生虫であるマラリア原虫にもRimM遺伝子は存在し、マラリア原虫の成長にも重要であることが別の研究から示唆されています。以上のことから、RimM遺伝子はトキソプラズマ原虫に限らずアピコンプレクサに属する寄生虫にとって普遍的に重要な遺伝子である可能性が示唆されました。

図2. 細胞内で増殖中のトキソプラズマ原虫を顕微鏡で観察した写真。TgRimMタンパク質（緑）はアピコプラスト（マゼンタ）に存在している。

本研究成果により、トキソプラズマが宿主の生体内環境に適応して病気を起こすために重要な遺伝子が多数発見されました。またその中にはTgRimM遺伝子のように他の寄生虫にも共通して存在するものも含まれていました。今回見つかった病原性に必須の遺伝子はアピコンプレクサに共通する『弱点』であると予想されることから、今後のマラリアやトキソプラズマ症に対する新規治療法やワクチンの開発が大いに期待されます。

本研究成果は、2024年7月31日（水）に米国科学誌「mBio」（オンライン）に掲載されました。

タイトル：“CRISPR screens identify genes essential for in vivo virulence among proteins of hyperLOPIT-unassigned subcellular localization in Toxoplasma”
著者名：Yuta Tachibana, Miwa Sasai and Masahiro Yamamoto
ＤＯＩ：https://doi.org/10.1128/mbio.01728-24

なお、なお、本研究は、AMED 新興・再興感染症に対する革新的医薬品等開発推進研究事業　「日本のトキソプラズマとクリプトスポリジウムが起こすヒト胞子虫類原虫症の病態理解・感染実態把握・制御に向けた総合的研究開発」の一環として行われました。