図1　ビリベルジン還元酵素の結晶状態での反応
結晶状態で酵素反応を進めると、ビリベルジンとビリルビンの混合状態を示す色（黄緑色）に変化する。（BV:ビリベルジン、BR:ビリルビン）

大阪大学大学院工学研究科の福山恵一招へい研究員/名誉教授は、宮崎大学和田啓准教授と久留米大学杉島正一准教授を中心とする研究グループ（農研機構・久留米高専・埼玉大学の研究者ら）に参画し、血液の分解プロセスの最終段階であり、新生児黄疸の原因にもなる生体内反応の仕組みをタンパク質の立体構造解析法を駆使して明らかにしました。

これまで有効なクスリがない黄疸の治療薬開発に大きな手掛かりを与えました。

本研究成果は2017年2月7日（英国時間10：00、日本時間19：00）に英国科学誌『Nature Communications 』で公開されました。

ビリベルジン還元酵素は、50年以上前に発見され、血液中の酸素運搬成分であるヘムの分解に機能することが知られていました。ビリベルジン還元酵素は、ビリベルジンの一部の二重結合を単結合に変換（C10位の還元反応を触媒）し、ビリルビンを産生します （図2） 。これまで、この反応がどのような機構で進むのかは謎に包まれており、さまざまな手法による研究が国際的に繰り広げられてきました。

ヘムは赤色、ビリベルジンは青色、ビリルビンは黄色を呈する色素です。例えば、打撲によるあざ（痣）が赤色→青色→黄色に変化しながら治癒するのは、まさに血液の分解過程を皮膚の上から見ていることになります （図3） 。また、ビリルビン（黄色）は通常は優れた抗酸化作用を発揮しますが、血液分解の盛んな新生児体内で過剰に存在すると重度の黄疸を引き起こし （図4） 、脳内に沈着して神経毒性をもたらします（ビリルビン脳症）。

研究チームは、ビリベルジン還元酵素がどのようにビリベルジンを取り込み、どのような仕組みでビリルビンに変換するのか、その分子レベルでの解明に挑みました。

図2　ビリベルジン還元酵素が担う生体内反応
本酵素は、NAD(P)H を補酵素として、ビリベルジン（左）をビリルビン（右）に変換する。

図3　あざ（痣）
打撲によるあざの治癒過程は、血液の分解反応が現れている。周囲の黄色い部分は、ビリルビンによる呈色。

図4　黄疸の主な原因
ビリベルジン還元酵素により作られるビリルビンは、黄疸の原因物質となっている。ビリルビンの過剰産生や排出異 常によりビリルビンが蓄積し、重篤な場合は脳症を引き起こす。

X線結晶構造解析方法は、タンパク質の立体構造を分子・原子レベル（Åオーダー：1 mの1/100億）で可視化する手法です。顕微鏡ではカタチが見えない非常に小さな分子でも、原子一つ一つを目で見ることができるようになります。研究チームは、ビリベルジン還元酵素—ビリベルジン—補酵素の3成分を結晶状態にして、大型放射光施設SPring-8においてX線回折データを収集しました。

構造解析で、これまで不明であったビリベルジン還元酵素がビリベルジンを結合した状態の立体構造決定にはじめて成功しました （図5） 。一般的には酵素は一つの基質を一つの場所で結合しますが、ビリベルジン還元酵素は非常に珍しいことに、基質（ビリベルジン）二分子を一つの場所で同時に結合することが分かりました （図6） 。さらに、このように二つのビリベルジンを同時に結合する意義を調べるために、明らかにした立体構造をベースにしてビリベルジン還元酵素を様々に改変し、どの部位が機能に必要なのかを分光学的な手法によって調べました。得られたすべてのデータを俯瞰することで、ビリベルジン還元酵素が他に類をみない反応機構でビリベルジンを還元することが見えてきました。すなわち、取り込まれた二つのビリベルジンのうち、片方がもう一方をビリルビンに変換する触媒として機能するという、非常にユニークな過程で反応が進行することがわかりました （図7） 。ビリベルジン還元酵素の結晶を用いてこの反応を結晶状態のまま進めると、青色結晶（2分子のビリベルジン結合の呈色）が黄緑色結晶（1分子のビリベルジン+1分子のビリルビンの呈色）に変化しました （図1） 。このことは、今回明らかにした機構を裏付けています。

図5　本研究で初めて決定したビリベルジン還元酵素-ビリベルジン-補酵素の立体構造
ビリベルジン還元酵素に二つのビリベルジン（Distal BV および Proximal BV）が結合することを明らかにした。

図6　結合したビリベルジンの構造
X線結晶構造解析によって可視化したビリベルジンの電子密度を表している。二つのビリベルジンが重なるように本酵素に結合する。さらに、一方のビリベルジン（Proximal BV）は、補酵素（NADP ⁺ ）に挟まれており、ビリルビンに変換され易い環境が作られている。

図7　ビリベルジン還元酵素の反応機構
ビリベルジン還元酵素に結合した二つのビリベルジンのうち、Distal BV は Proximal BV にプロトンを渡すことで、Proximal BV はビリルビンに変換される。一般的な酵素反応において、基質自身が触媒反応を担うことは極めて珍しい。さらに本酵素がユニークな点として、二つの同じ基質が同時に結合し、それぞれの役割が完全に異なっていることが挙げられる。

医学的な観点では、ビリベルジン還元酵素は黄疸の原因となるビリルビンを作り出すタンパク質として知られています。とくに、血液分解が盛んな新生児おいては、血中ビリルビン濃度の急激な上昇に排出が間に合わず、核黄疸（ビリルビン脳症）を引き起こします。現在、軽度の黄疸には、光によって変化したビリルビンが体から排泄されやすいという特性を利用した光照射治療が行われています。一方、重度の新生児黄疸では、有効な治療薬がないことから、血液の全交換の必要があります。ビリベルジン還元酵素の反応を阻害する薬剤が開発できれば、ビリルビン合成量の制御が可能になるため、画期的な黄疸治療薬となる可能性があります。本研究では、これまで謎に包まれていたビリベルジン還元酵素の反応機構を分子レベルで解明したことから、この立体構造およびユニークな反応機構をベースとした創薬開発（SBDD (Structure Based Drug Design)）が進むことが期待されます。

本成果は、以下の研究事業・資金的援助により得られたものです。
国立研究開発法人 科学技術振興機構科学技術人材育成費補助事業「テニュアトラック普及・定着事業（個人選抜型）」
文部科学省 科学研究費補助金 基盤研究（B）および基盤研究（C）

A substrate-bound structure of cyanobacterial biliverdin reductase identifies stacked substrates as critical for activity

Nature Communications, 8:14397, DOI: 10.1038/ncomms14397

Haruna Takao ^1,2 , Kei Hirabayashi ¹ , Yuki Nishigaya ³ , Haruna Kouriki ¹ , Tetsuko Nakaniwa ⁴ , Yoshinori Hagiwara ⁵ , Jiro Harada ⁶ , Hideaki Sato ⁶ , Toshimasa Yamazaki ³ , Yoichi Sakakibara ⁷ , Masahito Suiko ⁷ , Yujiro Asada ⁸ , Yasuhiro Takahashi ⁹ , Ken Yamamoto ⁶ , Keiichi Fukuyama ^4,10 , Masakazu Sugishima ^6,* , and Kei Wada ^1,*

¹ Organization for Promotion of Tenure Track, University of Miyazaki
² Graduate School of Medicine and Veterinary Medicine, University of Miyazaki
³ Advanced Analysis Center, National Agriculture and Food Research Organization
⁴ Department of Biological Sciences, Graduate School of Science, Osaka University
⁵ Department of Biochemistry and Applied Chemistry, National Institute of Technology, Kurume College
⁶ Department of Medical Biochemistry, Kurume University School of Medicine
⁷ Department of Biochemistry and Applied Biosciences, Faculty of Agriculture, University of Miyazaki
⁸ Department of Pathology, Faculty of Medicine, University of Miyazaki
⁹ Division of Life Science, Graduate School of Science and Engineering, Saitama University
¹⁰ Department of Applied Chemistry, Graduate School of Engineering, Osaka University
^* 責任著者