国立研究開発法人情報通信研究機構（NICT、理事長:坂内正夫）、国立大学法人北海道大学（総長:山口佳三）、国立大学法人大阪大学（総長:西尾章治郎）は、溶液中の蛍光分子の回転拡散運動を計測する方法の開発に成功しました。

これは、独自開発した検出器（超伝導ナノワイヤ単一光子:SSPD ）を蛍光相関分光顕微鏡（FCS） のカメラとして使うことで、従来はノイズに隠れて検出できなかった「回転拡散 」成分を検出することに成功したものです。従来法では、1台のカメラではタンパク質の回転拡散運動を計測することができず、そのため、その形状を同定することは困難でしたが、今回の開発で、タンパク質分子の回転拡散が測れるようになり、プリオン等の凝集性タンパク質 が凝集体を形成する初期段階、すなわち、タンパク質が2量体 や3量体になったことを、その形状から簡易に同定することが可能となります。

したがって、今回の開発は、凝集性タンパク質が原因となるアルツハイマー病やプリオン病などの神経変性疾患の初期段階を超早期に診断するのに極めて有効な手法となる可能性があります。また、今回の成果により、これまで主に通信分野で利用されてきたSSPDカメラの医療分野への応用が期待されます。

本研究成果は、12月14日付けの米国科学誌Optics Expressに掲載されました。なお、本成果の一部は国立研究開発法人科学技術振興機構（H25-26）及び国立研究開発法人日本医療研究開発機構(H27)の支援によるものです。

蛍光相関分光法（FCS）は、蛍光の自己相関 を利用して、細胞内タンパク質の拡散係数や分子間相互作用を簡便に求めることができるため、細胞生物学の分野で広く利用されています。従来のFCSでは検出器としてアバランシェ・フォトダイオード（APD） が使われてきましたが、1μs以下の時間領域の信号はAPDに特有のアフターパルス と呼ばれる雑音に埋もれて観測できませんでした。1μs以下の時間領域を高精度に計測することが可能になれば、回転拡散による信号からタンパク質分子の形状を同定することができるため、タンパク質2量体や3量体といったプリオンタンパク質の初期段階を検出できる可能性があり、凝集性タンパク質に起因した疾患の初期診断に極めて有効な手法となります。2013年にNICTは、通信波長帯（1550nm）でシステム検出効率80%を超える超伝導ナノワイヤ単一光子検出器（SSPD）の開発に成功し、量子暗号通信 への適用を進めてきました。

SSPDのアフターパルスのない極めて低雑音という特長は、FCSにおいても極めて有望であることから、NICTは、FCS応用のために必要となる可視波長領域 で高い検出感度を有するSSPDを開発し、2013年から北海道大学、大阪大学と共同でFCSシステム（右図）での性能評価を進めてきました。

これまでに、635nmでシステム検出効率76%を持つSSPDを開発し（補足資料 図1 ）、ローダミン 水溶液を用いた実験で、SSPDにより、1μs以下の時間領域まで理想的な自己相関曲線が得られることを確認していました。

超伝導ナノワイヤ単一光子検出器を組み込んだ蛍光相関分光システム

今回、この蛍光顕微鏡用に開発したSSPDを用いて、回転拡散による信号の検出に世界で初めて成功しました。

今回用いた測定試料は、Qrod と呼ばれる直径約7nm、長さ22nmの棒状分子で、このQrodが回転しながら拡散する様子を、SSPDを組み込んだ蛍光偏光相関分光法（pol-FCS）により観測しました（補足資料 図2 ）。

今回用いたQrodの回転拡散による信号は、その分子形状から1μs付近に現れることが予想されますが、従来のAPDでは、アフターパルスによる雑音に埋もれて観測できませんでした（補足資料 図3 (a)）。

そこで、今回、この蛍光顕微鏡用に開発したSSPDを用いることで、1μs付近にQrodの回転拡散による信号を観測することができました（補足資料 図3 (b)）。得られた信号の理論曲線によるフィッティングから求めた分子形状はQrodの形状とほぼ一致することから、SSPDにより観測した信号がQrodの回転拡散によるものであることが裏付けられました。

今回の成果は、NICTが可視波長SSPDの高性能化と測定試料の作製を、北海道大学は可視波長SSPDを組み込んだFCSシステムの構築と測定及びデータ解析と測定試料の作製、そして、大阪大学はFCSシステムの構築と測定試料の作製の役割分担を行い、本成果に至ったものです。

今回行った実験は、Qrodという回転拡散を観測するために人工的に合成した棒状分子ですが、今後は、実際にタンパク質多量体を用いて実験を行う予定です。また、今回のSSPDは、マルチモードファイバとの高効率な結合を実現するため比較的大きな受光面積（35μm径の円形受光面）を持ち、そのため、不感時間 が0.3μs程度でしたが、今後、SSPDを多ピクセル化することで不感時間を短縮し、1μs以下の計測精度を更に改善していく予定です。

このようなSSPDの性能改善により、今後は、FCSの高機能化、医療分野への普及展開を推進してまいります。

2015年12月14日付け
Optics Express (Vol. 23, Issue 25, pp. 32633-32642 (2015))
電子版: http://dx.doi.org/10.1364/OE.23.032633
掲載論文名: Rotational diffusion measurements using polarization-dependent fluorescence correlation spectroscopy based on superconducting nanowire single-photon detector
著者: Johtaro Yamamoto, Makoto Oura, Taro Yamashita, Shigehito Miki, Takashi Jin, Tokuko Haraguchi, Yasushi Hiraoka, Hirotaka Terai, and Masataka Kinjo,

Optics Express (Vol. 22, Issue 18, pp. 21167-21174 (2014)) 2014年9月に掲載済み
電子版: http://dx.doi.org/10.1364/OE.22.021167
掲載論文名: Multimode fiber-coupled superconducting nanowire single-photon detector with 70% system efficiency at visible wavelength
著者: Dengkuan Liu, Shigehito Miki, Taro Yamashita, Lixing You, Zhen Wang, and Hirotaka Terai

Optics Express (Vol. 22, Issue 23, pp. 28783-28789 (2014)) 2014年11月に掲載済み
電子版: http://dx.doi.org/10.1364/OE.22.028783
掲載論文名: Fluorescence correlation spectroscopy with visible-wavelength superconducting nanowire single-photon detector
著者: Taro Yamashita, Dengkuan Liu, Shigehito Miki, Johtaro Yamamoto, Tokuko Haraguchi, Masataka Kinjo, Yasushi Hiraoka, Zhen Wang, and Hirotaka Terai

2013年11月5日発表
「検出効率80%以上の「超伝導ナノワイヤ単一光子検出器」を開発 ～従来の3倍のシステム検出効率を達成！～」
http://www.nict.go.jp/press/2013/11/05-1.html

図1　可視波長SSPDの構造とシステム検出効率
・通信波長SSPDでは、熱酸化膜付きのシリコン（Si）基板上にナノワイヤを作製し、基板の裏面から光子を入射していましたが、可視波長帯ではSi基板の光吸収率が高いために、Si基板裏面側からの光子入射を適用できません。そこで、可視波長用のSSPDでは、可視波長領域で反射率が99%以上となる誘電体多層膜を反射層として採用し（ 図1 (a)）、Si基板表面側から光子入射することで、635 nmで95%を超える高い光吸収効率を実現しました。
・FCSでは、試料からの蛍光信号をコア径50 μmのマルチモードファイバを用いて検出器まで伝送します。コア径10 μmのシングルモードファイバと結合する通信波長SSPDでは、受光面は15 μm x 15 μmでしたが、可視波長SSPDでは、マルチモードファイバとの高効率な結合を実現するため、直径35 μmの円形受光面を採用しました（ 図1 (b)）。マルチモードファイバの先端にGRIN（グレーデッドインデックス）レンズを装着し、受光面で直径28 μmまで集光することで、ほぼ100%のファイバ結合効率を実現しました。
・可視波長用のキャビティ構造の採用、マルチモードファイバとの高効率な結合を実現した結果、635 nmの光子に対して76%のシステム検出効率を達成しました（ 図1 (c)）。

図2　蛍光偏光相関分光法（pol-FCS）、 (1) 測定系、(2) 測定原理
・蛍光分子が共焦点領域を出入りすることによる蛍光強度のゆらぎ（ 図2 (2)A: 並進拡散）のほかに、蛍光分子が回転することによって蛍光の偏光が変化します（回転拡散）。検光子（偏光板）を通して蛍光強度を測定することで、回転拡散によっても蛍光強度がゆらぎます（ 図2 (2)B）。 回転拡散によるゆらぎは、並進拡散のゆらぎよりも速いため、自己相関関数において速い成分として現れます（ 図2 (2)C）。

図3　蛍光偏光相関分光計測結果
・検出器としてアバランシェフォトダイオード（APD）を使用した場合、アフターパルスによる雑音成分（青矢印）に埋もれて、偏光依存のゆらぎによる信号（回転拡散成分）を観測できません（ 図3 (a)）。超伝導ナノワイヤ単一光子検出器（SSPD）を使用した場合、アフターパルスによる雑音成分がないため、検光子（偏光板）を通して観測した信号が回転拡散成分によるものであると同定できます（ 図3 (b)の赤矢印）。SSPDを用いて測定した自己相関曲線のフィッティングから算出した分子形状は、Qrodの形状を反映した値となり、観測した信号が回転拡散成分であることが裏付けられました。

図４）超伝導ナノワイヤ単一光子検出器についての補足の図

図５）蛍光相関分光法についての補足の図

図６）可視波長領域についての補足の図

大阪大学生命機能研究科　平岡研究室HP
http://www.fbs.osaka-u.ac.jp/labs/hiraoka/index.html

国立研究開発法人　情報通信研究機構
http://www.nict.go.jp/index.html