一般にX線結晶構造解析では、タンパク質立体構造を決定する際に、類似構造のタンパク質モデルを利用します。しかしながら、類似構造がないタンパク質の場合は、水銀、白金等の重原子を結合させたタンパク質の結晶を用い、その重原子からの異常分散効果 を利用して構造を決定します。最近では、タンパク質重原子化の手間を除くため、重原子の代わりにタンパク質の持つアミノ酸の「硫黄原子を利用した単波長異常分散法（S-SAD法） 」が用いられています。しかしながら、十分な大きさの結晶が得られない、また著しく放射線損傷を受けるタンパク質では、SPring-8 のような大型放射光施設のX線を利用してもS-SAD法により構造を決定することは困難です。

今回、共同研究グループは、これまでに開発した少量の試料でさまざまなタンパク質の回折実験が行える手法「グリースマトリックス法 」を用い、リゾチーム タンパク質の硫黄原子を利用した構造決定に成功しました。今後、結晶サイズ、放射線損傷の問題からこれまで構造決定が困難であったタンパク質でも、SACLAを利用したS-SAD法により構造決定が可能になります。また、創薬ターゲットとなる様々なタンパク質の構造解析への適用が期待できます。

本研究は、文部科学省 X線自由電子レーザー重点戦略課題「創薬ターゲット蛋白質の迅速構造解析法の開発」（研究代表者：岩田想）などの支援を受けて実施されました。また、本研究成果は、英国の科学雑誌『Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography』に掲載されるに先立ちオンライン版（11月30日付け）に掲載されました。

原子分解能でのタンパク質の三次元立体構造はその機能を理解するうえで重要な情報源となります。その立体構造を決定するには、タンパク質結晶を用いたX線結晶構造解析が適しています。大型放射光施設「SPring-8」の放射光 を用いる場合、一般に約30 マイクロメートル（μm）以上のタンパク質結晶が必要です。しかしながら、30 μm以上のタンパク質結晶を得るのは困難で、特に創薬などの研究用途で重要なヒトを含む動物由来のタンパク質は、結晶化に使用できる十分な量を得るのが難しく、析出する結晶も回折実験に適した十分なサイズに成長しません。また、回折実験ではタンパク質結晶が放射線損傷を受けることも大きな問題でした。

X線自由電子レーザー（XFEL：X-ray Free-Electron Laser）は、SPring-8の放射光より10億倍も明るいため、マイクロメートル（μm）かそれ以下のサイズのタンパク質微小結晶でも構造解析ができます。現在稼働中のXFEL施設は、理研の「SACLA」と米国のSLAC国立加速器研究所の「LCLS（Linac Coherent Light Source）」があり、また欧州、アジアでXFEL施設の建設計画が進行中です。

SACLAの10フェムト秒以下という超短時間でのX線レーザーの照射により、タンパク質が壊れる前に微結晶の回折イメージを検出できます。このXFELの特性を利用した主なタンパク質の構造決定法として、連続フェムト秒結晶構造解析（SFX：Serial Femtosecond Crystallography）が注目されています。主にジェットインジェクターと呼ばれる装置から噴出した多数の微小結晶を含む液体にX線レーザーを照射し、各結晶からの回折データを連続的に収集します。SFXは常温で実験を行えるため、従来の低温条件下（100 K程度）で行う回折実験とは異なり、生理条件（生体内）に近い構造を得ることができます。

X線結晶構造解析では、ターゲットタンパク質とよく似た構造が既にある場合、分子置換法 と呼ばれる構造決定法が用いられます。一方、類似構造が無い場合はタンパク質に水銀、白金等の重原子を結合させ、その重原子の異常分散効果を利用することで構造決定を行う方法を用います。しかしながら、タンパク質によっては結合する重原子が見つからない場合や重原子化により結晶に損傷を与えてしまう場合もあります。そのような場合、タンパク質が持つアミノ酸のセレン、システインの硫黄原子を利用した単波長異常分散法（S-SAD法）が利用できます。S-SAD法ではタンパク質が持つ硫黄原子を利用するため、得られた結晶をそのまま使える利点がありますが、重原子と比べて非常に弱い硫黄原子からの異常分散シグナルを利用するため、SN比の良い多くの回折イメージを収集する必要があります。本研究ではSACLAのX線レーザーを用いたSFXで、S-SAD法による初のタンパク質構造決定を試みました。

共同研究グループはこれまでにSFXにおけるサンプル供給手法として「グリースマトリックス法」の開発に成功しています 注1 。従来のジェットインジェクターを利用したサンプル供給では、構造を決定するために10～100 mgのタンパク質が必要でしたが、グリースマトリックス法では低速でサンプルを流すことができるため、その結果として1 mg以下のサンプル量での構造決定が可能です。本研究ではこのグリースマトリックス法を用い、測定波長1.77オングストローム（1Åは100億分の1m）で、サイズ約7～10 μmのリゾチーム結晶 （図1） から、回折分解能2.1Åの回折データを収集しました。

注1　2014年11月11日プレスリリース「連続フェムト秒結晶構造解析のための結晶供給手法を開発」
http://www.riken.jp/pr/press/2014/20141111_1/

図1　SFXで使用したリゾチーム結晶
リゾチーム結晶のサイズは、7～10μm。スケールバーは、50μm。

6時間程度の測定時間で構造解析に利用できる180,000枚の回折イメージを収集し、そのうち150,000枚のイメージを用いることでS-SAD法によるリゾチームの結晶構造の決定に成功しました （図2） 。これにより、SACLAのX線レーザーとグリースマトリックス法を使うことで、S-SAD法による構造決定に十分な精度の回折イメージを収集できることを実証しました。

図2　S-SAD法により決定したリゾチームのタンパク質結晶構造
図中の青色のメッシュは電子密度、赤色のメッシュは硫黄原子から検出した異常分散シグナル、メッシュ内スティックモデルの黄色は硫黄原子、青色は窒素原子、赤色は酸素原子、および灰色は炭素原子を示す。

SACLAの10フェムト秒以下という超短時間でのX線レーザーの照射を用いたSFXは、30 μm以下のサイズの、また放射線損傷を著しく受ける結晶から回折データを収集することができます。最近では京都大学中津亨准教授の研究グループにより、SACLAを利用した水銀誘導体タンパク質での新規結晶構造の決定に成功しています 。また、重原子化が難しいタンパク質サンプルではS-SAD法を利用することで、これまで解析が困難であったタンパク質の立体構造の決定が可能になります。このようにSACLAではタンパク質に応じて様々な構造解析法を利用できることが実証され、今後、創薬ターゲットとなる膜タンパク質 を中心とした様々なタンパク質の構造解析への適用が期待できます。

注2　 Keitaro Yamashita et al., An isomorphous replacement method for efficient de novo phasing for serial femtosecond crystallography (2015) Scientific Reports 5, 14017.

＜タイトル＞
Native sulfur/chlorine SAD phasing for serial femtosecond crystallography
＜著者名＞
Takanori Nakane, Changyong Song, Mamoru Suzuki, Eriko Nango, Jun Kobayashi, Tetsuya Masuda, Shigeyuki Inoue, Eiichi Mizohata, Toru Nakatsu, Tomoyuki Tanaka, Rie Tanaka, Tatsuro Shimamura, Kensuke Tono, Yasumasa Joti, Takashi Kameshima, Takaki Hatsui, Makina Yabashi, Osamu Nureki, So Iwata, Michihiro Sugahara
＜雑誌＞
Acta Crystallographica Section D: Biological Crystallography
＜DOI＞
10.1107/S139900471501857X