SFXには、試料に放射線損傷 を与えず、従来の低温条件下（100K、-173℃）で行う実験とは異なり、生理条件（生体内）に近い温度でのタンパク質の立体構造（結晶構造）を決定できるという特性があります。しかし、10～100 mgという大量のタンパク質から得た結晶を必要とするという課題がありました。そこで、共同研究グループは2014年、少量のタンパク質結晶を高粘度物質のグリースに混ぜてインジェクター（噴出装置）からゆっくりと押し出し、タンパク質結晶のX線回折を行うことができる「グリースマトリックス法」を開発しました 注 1） 。グリースマトリックス法では、従来の液状試料をインジェクターから噴出する「液体ジェット法」と比べ、構造解析に必要なタンパク質結晶の量を1/10～1/100（使用するタンパク質は1 mg以下）に軽減できました。しかし、グリースに由来する散乱バックグランドノイズは無視できないため、より低ノイズのヒアルロン酸をSFXに導入しましたが 注 2） 、その高い粘着力ゆえに安定に結晶を流すことが難しく、また非常に高価であることも問題でした。

今回、共同研究グループは、タンパク質結晶輸送媒体としてヒドロキシエチルセルロースを利用することで、ノイズ・粘着性・コストの問題を解決しました。

今後、ヒドロキシエチルセルロースを利用することで、創薬ターゲットを含む多様なタンパク質の高分解能結晶構造解析が可能になると期待できます。

本成果は、英国のオンライン科学雑誌『Scientific Reports』（4月6日号）に掲載されました。

本研究は、文部科学省X線自由電子レーザー重点戦略課題「創薬ターゲット蛋白質の迅速構造解析法の開発」（研究代表者：岩田想）などの支援を受けて実施されました。

注 1）　2014年11月11日プレスリリース「連続フェムト秒結晶構造解析のための結晶供給手法を開発」
http://www.riken.jp/pr/press/2014/20141111_1/

注 2）　2016年4月18日プレスリリース「結晶を損傷しない新しいタンパク質結晶の輸送媒体を発見」
http://www.riken.jp/pr/press/2016/20160418_1/

タンパク質の立体構造（結晶構造）を決定するには、タンパク質結晶にX線を照射したときに得られる回折イメージを解析する「X線結晶構造解析」が適しています。大型放射光施設「SPring-8 」の放射光 をX線結晶構造解析に用いる場合、実験中にタンパク質結晶に放射線損傷を与えることが大きな問題でした。

X線自由電子レーザー（XFEL：X-ray Free-Electron Laser）施設「SACLA」のX線レーザーは試料への照射時間が10 フェムト秒（1 フェムト秒は1,000 兆分の1 秒）以下という超短時間のため、タンパク質が壊れる前の微小結晶の回折イメージを検出できます。このX線レーザーの特性を利用した主なタンパク質の構造決定法として、「連続フェムト秒結晶構造解析（SFX）」が注目されています。SFXでは、インジェクター（噴出装置）から噴出させた液状試料（多数の微小なタンパク質結晶を含む液体試料）にX線レーザーを照射し、各結晶からの回折イメージを連続的に収集します（液体ジェット法）。SFXは常温で行うことができるため、従来の低温条件下（100 K、-173 ℃）で行う回折実験とは異なり、生理条件（生体内）に近い構造を得ることができます。しかし、この方法には10～100 mgという大量のタンパク質から得た結晶を必要とするという問題がありました。

共同研究グループは2014年、タンパク質結晶を高粘度物質のグリースに混ぜ、インジェクターからゆっくりと試料を押し出し、さまざまなタンパク質結晶のX線回折実験を行うことができる「グリースマトリックス法」を開発しました。グリースマトリックス法では、ゆっくりと試料を流すため、液体ジェット法の1/10～1/100に相当する1 mg以下のタンパク質試料での構造決定が可能になりました。しかし、グリースとタンパク質結晶を混合した際に、いくつかの試料で結晶に亀裂が入ったり、結晶が溶けたりするといった問題がありました。また、グリースに由来して回折イメージ上に現れるノイズ（散乱バックグランドノイズ）も無視できません。そこで、グリースと比較し回折イメージ上のノイズが低いヒアルロン酸をSFXに導入しましたが、その高い粘着力ゆえにインジェクターに吸着してしまうなど、安定に結晶を流すことが難しく、また非常に高価であることも問題でした。

今回、共同研究グループは、この問題を解決するため新たな結晶輸送媒体を探索しました。

共同研究グループは結晶輸送媒体として、ヒアルロン酸とよく似た高粘度で水溶性のハイドロゲル である「ヒドロキシエチルセルロース」を用いました。測定するタンパク質に選んだのは、結晶サイズ1 マイクロメートル（μm、1 μmは100万分の1 メートル）および 20～30 μm のリゾチーム、2～4 μmのソーマチンです。SACLA BL3で、ヒドロキシエチルセルロース水溶液に各タンパク質結晶を混ぜた試料を用いて、測定波長1.24もしくは0.95 オングストローム（Å、1 Åは100 億分の1 メートル）でSFXを行ったところ、それぞれ回折分解能 1.8、1.45、および1.55 Åの回折データセットを収集できました。約1 時間の測定時間で、構造解析に利用可能な30,000～40,000 枚の回折イメージを収集でき、これらのタンパク質結晶構造の決定に成功しました。その1例として結晶サイズ1 μmのリゾチームを用いて得られた結晶構造を 図1 に示します。

また、従来のグリースマトリックス法で結晶輸送媒体として使用していたグリースを不純物の少ないグリースに変更し、ヒドロキシエチルセルロース使用時とノイズを比較しました。このグリースは、従来のグリースに比べて、グリースに由来するノイズが低いという特徴がありますが、ヒドロキシエチルセルロースの方がより低ノイズであることを確認しました。さらに、ヒドロキシエチルセルロースを使用した場合、プロテイナーゼKに結合した金属からの弱いシグナルも検出することができ、そのシグナルを利用した構造決定にも成功しました。

以上の結果から、SACLAのX線レーザーを用いたSFXでは、結晶輸送媒体としてヒドロキシエチルセルロースを使うことで、結晶サイズ1 μmでも結晶構造の決定に十分な精度の回折イメージを収集できることが実証されました。また、コストもヒアルロン酸に比べて約1,000分の1、不純物の少ないグリースに比べても約2分の1に抑えることができました。

図1　ヒドロキシエチルセルロースを用いて決定したリゾチームの結晶構造
結晶輸送媒体として、高粘度のヒドロキシエチルセルロースを用いて、結晶サイズ1 μmのリゾチームから1.8 Å分解能で結晶構造決定に成功した。図中のピンク色のメッシュは電子密度、メッシュ内スティックモデルの黄色は硫黄原子、青色は窒素原子、赤色は酸素原子、灰色は炭素原子を示す。

現在、結晶輸送媒体としてヒドロキシエチルセルロース、グリースを用いて、さまざまなタンパク質のSFXを行っています。最近では、ヒドロキシエチルセルロースを用いたSFXで最高分解能1.20 Åでの酵素の構造解析に成功しました 注 3） 。またグリースを用いて、光合成の水分解反応において、光化学系Ⅱ複合体が酸素分子を発生させる直前の状態の立体構造を決定することに成功しました 注 4） 。このタンパク質の場合、ヒドロキシエチルセルロースを用いると結晶に損傷を与えてしまいます。

今後、ヒドロキシエチルセルロース、グリースなどを相補的に利用することで、創薬ターゲットとなる膜タンパク質 を中心とした多様なタンパク質の高分解能での構造解析が期待できます。

注 3）　2017年3月31日プレスリリース「酵素の立体構造、「SACLA」のX線レーザーを用いて常温、原子分解能構造解析に成功」
http://www.spring8.or.jp/ja/news_publications/press_release/2017/170331/

注 4）　2017年2月21日プレスリリース「光化学系Ⅱ複合体が酸素分子を発生する直前の立体構造を解明」
http://www.okayama-u.ac.jp/tp/release/release_id448.html

＜タイトル＞
Hydroxyethyl cellulose matrix applied to serial crystallography

＜著者名＞
Michihiro Sugahara, Takanori Nakane, Tetsuya Masuda, Mamoru Suzuki, Shigeyuki Inoue, Changyong Song, Rie Tanaka, Toru Nakatsu, Eiichi Mizohata, Fumiaki Yumoto, Kensuke Tono, Yasumasa Joti, Takashi Kameshima, Takaki Hatsui, Makina Yabashi, Osamu Nureki, Keiji Numata, Eriko Nango & So Iwata

＜雑誌＞
Scientific Reports

＜DOI＞
10.1038/s41598-017-00761-0