図1. ADHの膜結合領域同定とsADHの構築 ©️京都大学（イラストレーター：田中 花音）

酸化還元酵素は、生体内電子伝達において重要な働きを担う触媒であり、常温・常圧・中性条件で高い基質選択性を有します。近年、酸化還元酵素と電極が直接電子を授受する「直接電子移動型酵素電極反応（DET型反応）」が、生体/環境適合性の高い反応系として注目されています。DET型反応が可能な酵素（DET酵素）の中でも、酢酸菌Gluconobacter属由来の膜結合型脱水素酵素群は、卓越したDET活性を有するモデル酵素として研究されてきました。一方、本酵素群が膜酵素であることに起因して、産業利用に向けたいくつかの課題が存在しました。第一に、膜酵素は一般的に疎水性が高く、ミスフォールディングが起きやすいため、異種大量発現系の構築が困難です。また、膜酵素の精製には、界面活性剤を用いた長時間の可溶化プロセスが必須であり、精製コストの増加や酵素の失活を引き起こします。さらに、膜酵素に共存する界面活性剤が、DET型反応に影響を及ぼすことも知られています。よって、高いDET活性を維持した状態で、膜酵素を可溶化酵素にする手法が求められていました。そこで本研究では、Gluconobacter oxydans由来のADHに着目しました。本酵素は、ヘテロ三量体の膜酵素であり、触媒反応部位であるピロロキノリンキノン（PQQ）とヘムc（ヘムcLと呼称）を有するLサブユニット、3つのヘムc（N末端からヘム1c、2c、3cと呼称）を有し、膜結合を担うCサブユニット、Sサブユニットから構成されます。基質であるエタノールはPQQで酸化され、酸化反応に伴って生じる電子は、ヘムcを介して生体内では疎水性電子受容体であるユビキノン（UQ）に、DET型反応では電極に受け渡されます。ADHの全体構造は、2023年に解明された一方、本酵素の膜結合領域は未知でした。本研究では、ADHの膜結合領域を同定し、ADHのDET活性を低下させることなく、界面活性剤フリーのADH可溶化変異体（sADH）を構築することを目的としました。

１．ADHの膜結合領域推定と可溶化変異のデザイン
ADHの膜結合領域を予測するため、ADHのCryo-EMマップ（図2A、EMDB：EMD-34368）とPDB構造（図2B、PDB：8GY2）に着目しました。Cryo-EMマップの赤点線で囲まれた部分に、界面活性剤由来のノイズを確認することができます。本ノイズは、Cサブユニットの一部が局所的に疎水性を有していることを示しています。また、本ノイズに対応する位置に、疎水性電子受容体であるUQの結合領域が存在していました。UQ周辺のアミノ酸に着目すると、側鎖が溶媒側に露出した疎水性アミノ酸残基が多数存在していました（図2C）。これらの構造的特徴に基づき、Cサブユニット内に3つの膜結合領域（領域1：P77–I78、領域2：W159–F174、領域3：G212–M215）を推定しました。

図2. （A）ADHのCryo-EMマップ。（B）ADHのPDB構造。（C）ユビキノン結合領域周辺の拡大図。
また、膜結合領域の欠損による構造変化や安定性低下を防ぐため、欠損領域にグリシンリンカーを挿入しました。構造予測ツールAlphaFold3で生成した予測構造に基づいて、各領域の変異（Δ1：P77–I78をジグリシンリンカーに置換、Δ2：W159–F174をテトラグリシンリンカーに置換、Δ3：グリシンリンカー無しでG212–M215を欠失）を設計しました。

２．膜結合領域の同定とsADHの開発
野生型組み換えADH（rADH）と単一および多重欠失ADH変異体（Δ1、Δ2、Δ3、Δ1Δ2、Δ1Δ3、Δ2Δ3、Δ1Δ2Δ3）を構築し、粗酵素溶液における可溶性画分と膜画分の酵素活性局在を評価しました（図3）。rADHでは、総活性の77±4%が膜画分に存在していた一方で、Δ2変異体では、総活性の90±3%が可溶性画分に存在していました。本結果は、領域2がADHの膜結合において重要な役割を担うことを示しています。全ての変異体の中で、Δ1Δ2Δ3変異体は、可溶性画分において最も高い相対活性（95±3%）を示し、3つの推定膜結合領域が全て膜結合に関与していることが示唆されました。また、3領域が膜結合に関与していることは、脂質膜–ADH複合体の分子動力学シミュレーションの結果からも支持されました。よって、Δ1Δ2Δ3変異体をADH可溶化変異体（sADH）とし、可溶性画分から界面活性剤を用いずに精製することに成功しました。

図3. rADHおよび構築されたADH変異体発現株の粗酵素溶液におけるエタノール酸化活性の局在。

3．sADHの特性評価
Cryo-EMを用いた構造解析の結果、sADHが2つの構造を有することを確認しました（図4）。両構造を比較すると、赤点線で示した変異導入部位周辺に構造変化があることがわかります。この結果は、本可溶化手法が予期せぬ構造変化を完全には防げなかったことを示しています。一方で、Cサブユニットの大部分やサブユニット界面は安定して保存されていました。また、rADHおよびsADHを用いて酵素機能電極を作製し、両電極のDET活性を評価しました（図5）。sADHは明瞭なDET活性を示し、DET活性を維持した状態での可溶化変異導入に成功したことが示されました。さらに、sADHのDET活性がrADHと比較して約2倍に増加していることが確認できました。本結果は、変異導入により酵素配向が改善され、DET型反応に有効な酵素吸着量が増加したことを示唆しています。

図4. sADHの構造。（A）Form 1（PDB：9X0Q）、（B）Form 2（PDB：9X0R）。

図5. 酵素機能電極を用いて測定された電流－電圧曲線。
（黒：rADH、赤：sADH、実線：基質あり、破線：基質なし）

本研究では、膜結合型DET酵素であるADHに着目し、ADHの膜結合領域を推定しました。変異体設計や脂質膜-酵素複合体の再現に計算科学的手法を取り入れ、界面活性剤不要のADH可溶化変異体を構築しました。また、構造解析および電気化学測定によりsADHの特性評価を行い、sADHが高いDET活性を有することが示されました。本研究で着目した領域1から3は、同じく酢酸菌Gluconobacter属の膜結合型DET酵素であるアルデヒド脱水素酵素、フルクトース脱水素酵素にも保存されています。本可溶化手法をこれら酵素に応用することで、膜結合領域の相同性に基づく生理機能の解明に繋がります。さらに本研究は、応用利用に向けたDET酵素の機能向上と、生体/環境適合性の高い生物電気化学デバイス構築に貢献します。