図. 細胞膜から遊離した高活性FDH変異体によるDET型反応

酵素は、常温・常圧・中性pHといった穏和な条件下で働く生体触媒であり、環境負荷の少ない化学反応を可能にすることから、低炭素社会の実現に向けた有望な触媒材料と位置付けられています。中でも酸化還元酵素は、呼吸・光合成・発酵などの生体内電子移動反応に関与し、多彩なバイオプロセスへの応用が可能です。近年、電気回路を介して酸化還元酵素反応を人為的に制御する技術として、「直接電子移動型酵素電極反応（DET型反応）」が注目されています。本反応では、仲介分子を用いずに、酵素と電極が直接電子をやり取りします。よってDET型反応は、生体/環境適合性・設計自由度・物質－エネルギー変換効率に優れており、バイオセンサやバイオ燃料電池、バイオリアクタなどの生物電気化学デバイスへの実装が期待されています。

本研究では、酢酸菌が保有する膜結合型フルクトース脱水素酵素（FDH）に着目しました。FDHは、フルクトース（果糖）を酸化するヘテロ三量体膜酵素であり、界面活性剤を用いて精製されます。精製された本酵素を電極上に吸着させると、DET型反応における高い活性を確認することができます（図1）。しかし、酵素精製の過程で必須となる界面活性剤は、電極表面に酵素と競合的に吸着することが知られており、結果としてDET型反応効率を低下させる要因となります。本課題の克服に向けて、界面活性剤を用いずにFDHを精製する手法が求められていました。私たちは、酵素の立体構造を踏まえ、FDHがCサブユニットのヘム1c領域とC末端疎水性領域（CHR）を介して細胞膜に結合していると推定しました。これまでの研究より、ヘム1c領域とCHRはDET型反応に直接関与しないことが解明されています。そこで、両者を切除することで酵素が細胞膜から自発的に遊離し、界面活性剤フリーの精製が可能になるのではないかと考えました。本仮説を検証するため、ヘム1c領域とCHRを切除した二重変異体（Δ1cΔCHR_FDH）を開発しました。

図1. FDHによるDET型反応の模式図

１．FDH変異体の可溶化に成功
当初の期待通り、Δ1cΔCHR_FDHは可溶性画分に発現し、界面活性剤フリーの精製に成功しました。なお、ヘム1c領域とCHRのいずれか一方を欠損した変異体（Δ1c_FDHおよびΔCHR_FDH）は膜画分に発現したことから、FDHが2か所の膜結合領域を有していることも確認できました。次に、大阪大学大学院生命機能研究科 日本電子YOKOGUSHI協働研究所のクライオ電子顕微鏡を用い、Δ1cΔCHR_FDHの単粒子像解析を実施しました。その結果、2.15 Åの高分解能で立体構造の解明に成功しました。図2は野生型組換えFDH（rFDH）とFDH変異体の立体構造です。切除した領域を除き、立体構造が保持されていることが分かります。

図2. rFDH（左）とΔ1cΔCHR_FDH（右）の立体構造 白：ヘム1c領域、黒：CHR

２．Δ1cΔCHR_FDHの電気化学特性評価
次に、多層カーボンナノチューブ電極を用いて、Δ1cΔCHR_FDHのDET型反応特性を検証しました。本変異体のDET型反応速度（フルクトース酸化反応で生じる触媒電流密度）は、rFDHと比較して14倍に向上しました（図3）。また、精製後の酵素溶液に界面活性剤を添加し、同様にΔ1cΔCHR_FDH修飾電極を作製・評価したところ、触媒電流密度は約10分の1に低下しました。さらに、電流電圧曲線の速度論解析を実施し、Δ1cΔCHR_FDHのDET型反応が促進された要因を調べました。その結果、①DET型反応に関与しない領域の切除による酵素サイズの縮小、②界面活性剤の除去、という2つの要素に基づき、酵素が電極表面に高密度に吸着したと結論付けることができました。これにより、酵素の立体構造を踏まえた膜結合領域の切除が、DET型反応特性の向上に効果的であることを実証しました。

図3. DET型フルクトース酸化反応を示す電流－電圧曲線
（黒：rFDH、赤：Δ1

体触媒である酵素は、その高い活性と反応選択性に基づき、次世代のグリーン触媒として注目されています。本研究成果は、他の膜酵素への応用可能性を示すとともに、膜酵素の構造的理解をさらに深めるものです。そして、構造生物電気化学のアプローチに基づく酵素の合理的設計手法の確立に繋がります。今後、開発した変異体を活用した高性能な生物電気化学デバイスの実用化にも貢献できると期待されます。