図1. 今回の研究で明らかになった F1部分の構造.
左: 横から見た F1部分のクライオ電子顕微鏡マップ。右：点線で囲った部分を下から見た図。触媒部位が存在する3つのβ（赤、紫、青）が、α(灰色)を挟んで交互に並び、中心にγがある。ヌクレオチドを持たない初期状態（ND structure）では、3つのβが開構造をとる。Walker構造では、3つのβは、閉、閉、開構造をとる。

私たちの生命は、ATP(アデノシン三リン酸)を加水分解することによって得られるエネルギーで生命活動を維持しています。ほとんどの ATP は回転分子モーターである F_oF₁-ATPaseによって合成されます。F_oF₁ は、親水性のF₁部分と膜内在性の F_o から構成されます。単離した F₁ は、３つのαβからなるシリンダー構造 (α₃β₃)の中心に回転軸であるγサブユニットが刺さった構造からなります（図１）。F₁部分単独でATPase 活性を持つことから F₁-ATPase と呼ばれ、1970年頃から現在に至るまでF₁-ATPaseを使った多くの研究が行われてきました。1994年にX線結晶構造解析により F₁-ATPase の構造が明らかになりました。その構造では、３つの βサブユニット は、それぞれ異なったヌクレオチド結合状態をとり、1つには ATP が結合 (β_TP)、もう一つには ADP(β_DP)が結合、最後のものにはなにも結合していませんでした (β_E)。そして、β_TPとβ_DPは、閉じた構造、β_E は、開いた構造になっていました。我々はこの構造を ”Walker 構造” と呼んでいます。定常状態での回転では、3つの β サブユニット上において、協働的にヌクレオチドの結合状態や構造を変化させることで、連続的にγサブユニットを回転させます。しかし、ATPが一つの触媒部位にしか結合できない条件 (ユニサイト条件)では、ATPに対して非常に高い親和性 (Kd = 10^-12) を示し、しかも結合した ATPをゆっくりと加水分解することが報告されていました（ユニサイト触媒）。このユニサイト触媒機構と定常状態での触媒機構との関係を解明することは、回転分子モーターの分子機構を理解する上で必要です。しかし、1994年以降、定常状態での回転機構に対する研究が進む一方、ユニサイト触媒の分子基盤は、わからないままでした。

京都産業大学の中野 敦樹（博士1年）、横山 謙教授、大阪大学の岸川 淳一助教（蛋白質研究所）、光岡　薫教授（超高圧電子顕微鏡センター）、中西 温子日本学術振興会特別研究員（超高圧電子顕微鏡センター）らのグループは、クライオ電子顕微鏡を用いることにより、ユニサイト触媒が起こる前後の構造を捉えることに成功しました。クライオ電子顕微鏡による構造解析は、X線結晶構造解析で得ることのできなかった一過性の中間体構造を決定することができます。 透析処理によって内在性のヌクレオチドを取り除いた F_oF₁ を用い、F_oF₁の量に対して約1/3量のATP を加え、反応中に急速凍結しました。　得られた凍結グリッドをクライオ電子顕微鏡で撮影し、その画像を解析することで、すべての触媒サブユニットにヌクレオチドが結合していないND 構造と1つの触媒サブユニットにADP が結合したUS 構造 (ユニサイト構造)が得られました。ND構造は、Walker 構造 と大きく異なっており(図1)、3つのβ がすべて開いた構造をとっていました。 US構造では、β_TP に ATP ではなく、加水分解後の ADP が結合していました。この結果から、ユニサイト触媒では、ATPはβ_DP ではなく、β_TP に結合し、β_TP で加水分解が起こるということが明らかになりました。以上のことから、F_oF₁ にヌクレオチドが結合していない初期状態から定常状態までのモデル(図2)を提案し、長年の議論に終止符を打つことができました。

図2. F₁部分のスタートアップ機構
初期状態(ND structure)にATPが結合すると、1つのβが閉じ、加水分解、リン酸の放出まで起こったのがユニサイト構造（US structure）である。さらに、もう一つのATPが結合し、120°回転すると定常状態であるWalker構造に移行し、連続的に回転しながらATPを加水分解する。

本研究により、ユニサイト触媒の分子基盤、定常状態へと移行する過程を解明することができました。ATP駆動性の回転分子モーターの仕組みを理解するのに必要な重要なピースが埋まったといえます。このナノサイズで機能する分子機械の仕組みを理解することで、将来のナノマシーンの駆動部に応用できる人工分子モータータンパク質設計への応用が期待されます。