JST戦略的創造研究推進事業において、理化学研究所の袖岡幹子主任研究員と大阪大学大学院理学研究科の村田道雄教授らは、脂質ラフト の重要な構成成分であるスフィンゴミエリン に小さな目印を付けることで、その分布の正確な観察に成功しました。

脂質ラフトは細胞膜中の微小領域で、免疫細胞応答やウイルスの侵入、シグナル伝達といった生体現象に関与し、スフィンゴミエリンなど特定の脂質分子が特異的に集合することで形成されます。これらの脂質分子に膜たんぱく質が結びつき働くことでシグナル伝達などが促進されるため、脂質の分布は生命現象や疾患のメカニズムを知る上で重要な情報です。これまで、目的の脂質分子に蛍光分子を結合させた蛍光脂質 を観測することで可視化されてきましたが、大きな蛍光分子との結合により脂質本来の性質を失うことが問題でした。本研究ではラマン散乱顕微鏡 に着目し、アルキン を観測の目印としてスフィンゴミエリンに結合させることで、スフィンゴミエリンのみを検出し、脂質本来の性質を失うことなくその空間分布を正確に観測することができました。

本研究では大阪大学大学院工学研究科の藤田克昌准教授らが開発した高速・高感度なラマン散乱顕微鏡を用い、単分子の人工脂質ラフト膜 におけるスフィンゴミエリンの分布の観察に成功しました。また、ラフトに相当する領域内では均一に分布していると思われていたスフィンゴミエリンの濃度が、中心から周辺にかけて徐々に変化していくという新たな知見が得られ、脂質膜の分析や動態の解明への貢献が期待されます。

本研究成果は、2015年3月30日（米国東部時間）の週に米国科学アカデミー紀要（PNAS）のオンライン速報版で公開されました。

ヒトを構成する細胞の一つ一つは、外部と内部を隔てる膜に包まれています。この膜は脂質二重膜と呼ばれる構造をとっており、多種多様な脂質分子とたんぱく質から構成され、細胞や細胞内器官の環境を規定するとともに、情報伝達、物質輸送、エネルギー生成などの中心的役割を担っています。従来、その機能の大部分は膜たんぱく質が担っており、膜脂質は二重膜の材料であると考えられてきましたが、近年、膜脂質がたんぱく質との相互作用を介して特異的かつ多様な生理機能を担うことが明らかになってきました。なかでも、細胞膜にコレステロールやスフィンゴミエリンなどの特定の脂質分子が集合して形成される脂質ラフトは、免疫細胞応答やウイルスの侵入、シグナル伝達といった種々の細胞プロセスに関与していると考えられています。その重要な構成成分であるスフィンゴミエリンの分布や動態の解明は脂質ラフトが関与する疾患の解明や病態の診断などに寄与することが期待されます。目的の分子の分布を可視化するためには蛍光物質を付け、蛍光顕微鏡で観察することが一般的ですが、スフィンゴミエリンの場合には、大きな蛍光分子を結合することにより、その性質が変化するため、正確な観察は難しいのが現状です。

本研究グループは、脂質膜におけるスフィンゴミエリンのありのままの分布を観察するため、ラマン分光法に注目しました。物質に光を照射すると、光と物質の相互作用により、反射、屈折、吸収のほかに、散乱という現象が起こります。散乱光の中には、入射した光と異なる波長となる光があり、これをラマン散乱光と呼びます。物質に固有のラマン散乱光の性質を調べることにより、物質の分子構造や結晶構造を知る手法がラマン分光法です。

ラマン散乱顕微鏡は、原子の結合状態（分子の振動）を識別して、その空間分布を検出できるため、蛍光物質を付加することなく、目的の分子の分布を直接観察できます。まず、小さな目印となるアルキンを、スフィンゴミエリンに結合し、ジイン－スフィンゴミエリン を作成しました。生体物質に含まれない炭素間三重結合を持つアルキンを結合させ、ラマン顕微鏡を用いることで、分子構造の似通った複数種の脂質が複雑に混ざり合った膜の中でも、スフィンゴミエリンのみを選択的に検出し、正確に観測することができます。

このジイン－スフィンゴミエリンと天然型スフィンゴミエリンの性質の類似性を調べた結果、分子の構造や大きさ、コレステロール存在下での運動性など、お互い非常に良く似た性質を示しました。すなわち、ラマン散乱顕微鏡で検出できるジイン－スフィンゴミエリンはスフィンゴミエリンの代わりに使用できることを示します。そこで、ジイン－スフィンゴミエリンを用いて単層人工脂質ラフト膜を形成したところ、ラマン散乱顕微鏡でジイン－スフィンゴミエリンの分布を観察することができました。これは、人工脂質ラフト膜で初めてスフィンゴミエリンの分布の詳細を明らかにした例といえます。単層脂質膜は非常に薄く、また、ラマン散乱光は極めて微弱であるため、可視化することは不可能と考えられてきました。本研究グループはラマン錯乱顕微鏡の観測結果を、従来の100倍以上高速に画像化できる技術（スリット走査による高速ラマンイメージング ）を用い、単層脂質膜を観察することに成功しました。

細胞膜における脂質分子の分布は均質ではなく、一部の脂質分子が特異的に集まって、脂質ラフトとなる領域を形成しています。これまで、脂質ラフト膜は、スフィンゴミエリンが多い領域（ラフトドメイン）と、スフィンゴミエリンが少ない領域（非ラフトドメイン）とに、明確に分かれていると想定されていました（ドメイン共存モデル） （図1） 。しかし、安藤潤博士研究員、木下祥尚特任助教(現九州大学助教)は、ラマン散乱顕微鏡を用いた観察により、人工脂質ラフト膜におけるジイン－スフィンゴミエリンの濃度は、ラフトドメインの中心からその周辺にかけて“徐々に”減少することを見いだしました （図2） 。この結果は、スフィンゴミエリン濃度を徐々に変化させることで、ラフトドメインと非ラフトドメイン間で膜の厚さに差が生じないようにしていることを示唆しています。本研究成果は、ドメイン共存モデルとは異なる、新たな脂質ラフトのモデルを提起するもので、単一のラフトドメイン内でも、場所ごとに異なる機能や役割を持つ可能性を示します。

本研究グループは、高速画像化が可能なラマン散乱顕微鏡とジイン－スフィンゴミエリンを用いることで、脂質膜の性質を変えることなく、非常に薄い単層脂質膜レベルの観測を可能としました。さらに、ジイン－スフィンゴミエリン濃度がラフトドメインの中心から外側の非ラフトドメインにかけて“徐々に”減少していく様子を可視化することにも成功しました。この結果は、これまで想定されてきたドメイン共存モデルとは異なる、新しい脂質ラフトのモデルを提起するものです。これらの研究成果は、脂質膜の分析や脂質ラフトの研究を加速させると期待されます。 生体膜に存在する脂質ラフトは人工脂質ラフト膜とは異なり、動的な構造です。今後は、脂質分子の分布を時系列で観察するためのラマン顕微鏡の感度と画像化速度のさらなる向上や、より優れた脂質プローブの開発が望まれます。

なお、ラマン分光と脂質分子を標的とする本研究は、戦略的創造研究推進事業チーム型研究（CREST）の研究領域「疾患における代謝産物の解析および代謝制御に基づく革新的医療基盤技術の創出」における研究課題「生理活性代謝物と標的タンパク質同定のための基盤技術の創出」（平成25年10月～平成31年3月）の中で引き続いて進められています。

図1　ドメイン共存モデル
細胞膜における脂質分子の分布は均質ではなく、一部の脂質分子が特異的に集まって、脂質ラフトとなる領域を形成している。これまで、脂質ラフト膜は、スフィンゴミエリンが多い領域（ラフトドメイン）と、スフィンゴミエリンが少ない領域（非ラフトドメイン）とに、明確に分離していると想定されていた。

図2　ジイン－スフィンゴミエリンの分布解析
(Ａ)ジイン-スフィンゴミエリン／ジオレイルホスファチジルコリン／コレステロール をモル比1：1：1で混合した三成分人工脂質膜におけるジイン-スフィンゴミエリンの分布をラマン顕微鏡で分析。アルキンに由来するラマン散乱の強度（信号強度）をプロットした。信号強度が高いほど、ジイン-スフィンゴミエリンの濃度が高い。
(Ｂ)は(Ａ)のモデル図。スフィンゴミエリン濃度が徐々に変化することで、ラフトドメインと非ラフトドメインという膜の厚さが違う領域がなめらかにつながっていると考えられる。

図3　脂質ラフトの模式図

図4　高速イメージングを実現する仕組みの模式図

“Sphingomyelin distribution in lipid rafts of artificial monolayer membranes visualized by Raman microscopy” （人工ラフト膜内におけるスフィンゴミエリンの不均一な分布を可視化～ラマン顕微鏡が明らかにする脂質分布の不均一性～） doi: 10.1073/pnas.1418088112