iPS細胞は、分化した体細胞に転写因子 セットを導入すること（リプログラミング）で作製される多能性幹細胞 であり、再生医療や創薬への応用が期待されています。しかし近年、iPS細胞には点突然変異（点変異） が全ゲノムの様々な領域に存在することが報告され、移植後のがん化などへの関与が懸念されています。これらの点変異の特徴やゲノム上での分布パターンについては明らかになっておらず点変異が安全性やがん化などに及ぼす影響の評価は困難でした。

今回、共同研究グループは、マウスおよびヒトiPS細胞樹立時のリプログラミングの際に生じた点変異のデータと、ヒストン修飾 などのエピゲノム データを統合し、点変異のゲノム上の分布パターンを全ゲノムレベルで調べました。その結果、マウスとヒトいずれにおいても、点変異はタンパク質をコードしている遺伝子領域およびプロモーター やエンハンサー などの遺伝子発現調節領域では低密度でした。これは、ヒトの疾患に関連する一塩基多型（SNP） が遺伝子発現調節領域に濃縮しているのとは対照的です。一方で点変異の多くは、細胞内の核膜直下に位置する核ラミナ結合領域（LAD） に高密度に存在していました。LADは遺伝子密度が比較的低く、DNAが高度に凝縮され、DNAからRNAへの転写が抑制された領域です。すなわち、iPS細胞におけるゲノム変異の多くが、遺伝子発現に影響を与えない“良性の変異”であることが示されました。さらに、リプログラミングの際に①細胞質内のミトコンドリア から活性酸素 が一過的に放出される、②放出された活性酸素によって核内の核表面に近いLADに点変異が生じる、③LADにはDNA修復酵素が届きにくいため点変異が高密度で蓄積する、というメカニズムが考えられました。

今後、iPS細胞の臨床試験例を積み重ね、ゲノムデータと臨床データを紐づけることで、これらのゲノム変異がもたらす影響について実証され、安全で有効な治療が展開されるものと期待できます。

本研究は、米国のオンライン科学雑誌『Cell Reports』に（10月10日付け：日本時間10月11日）に掲載されました。

iPS細胞（人工多能性幹細胞）は、皮膚線維芽細胞などの体細胞に山中4因子（Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4）と呼ばれる転写因子を導入すること（リプログラミング）により作製される多能性幹細胞であり、再生医療や創薬への応用が期待されています。しかし近年、iPS細胞におけるゲノム変異が報告され、移植後のがん化などへの関与が懸念されています。

iPS細胞一つから検出される点突然変異（点変異）は数百個程度といわれています。それらの点変異には、iPS細胞の親細胞にもともと存在した変異のほかにも、iPS細胞を樹立する際に新たに生じた変異も存在します。これまで、iPS細胞を用いた全ゲノムシーケンス解析 が行われていますが、点変異の特徴やゲノム上での分布パターンについては明らかではありませんでした。特に、ゲノムの約98％はタンパク質に翻訳されない非コード領域であり、これらの領域におけるゲノム変異がiPS細胞の性質に与える影響はほとんど分かっていませんでした。そのため、点変異が安全性やがん化などに及ぼす影響の評価は困難でした。

そこで、共同研究チームは、iPS細胞樹立時に発生する点変異についての解析を試みました。

共同研究チームはまず、既に全ゲノムシーケンス解析で得られていたマウスのiPS細胞樹立時に生じた2,167の点変異（iPS細胞6株分）のデータを用いて、これらの変異のゲノム上での分布を調べました。その結果、点変異はタンパク質をコードする遺伝子上には1％程度しかなく、そのほとんどが非コード領域に存在することが明らかになりました。また、各ゲノム領域における点変異の密度を解析したところ、遺伝子と遺伝子の間の領域（遺伝子間領域）で高密度であることが分かりました。

次に、点変異データをChIP-seq解析 などで得られたエピゲノムデータと統合することにより、遺伝子発現調節領域であるプロモーターとエンハンサーにおける点変異の密度を解析したところ、いずれにおいても低密度であることが分かりました。また、iPS細胞を作製する際に転写因子を導入するには、レトロウイルスベクター やエピソーマルベクター を用います。どちらのベクターを用いてiPS細胞を樹立しても、上記と同様の傾向がみられました。

また、マウスのiPS細胞樹立時に生じた点変異は、トランスバージョン型 優位の変異パターンを示すことが報告されています。この変異パターンは酸化ストレス によって引き起こされる変異の特徴であり、その一つである8-oxo-グアニン は核膜直下の核ラミナ結合領域（LAD）に多く認められることが報告されています。そこでLADに着目し、この領域における点変異の密度を解析したところ、高密度であることが分かりました。

続いて、既に全ゲノムシーケンス解析で得られていたヒトのiPS細胞における5,448の点変異（iPS細胞9株分）のデータを用いて、これらの点変異のゲノム上における分布を調べたところ、マウス同様に点変異は99％以上が非コード領域に存在しており、遺伝子間領域で高密度であることが分かりました。また、エピゲノムデータとの統合解析結果もマウスと同様で、プロモーターやエンハンサーなどの遺伝子発現調節領域では低密度でした。一方、転写不活性領域であるヒストンH3リジン9トリメチル化（ヒストンH3の9番目のリジンをトリメチル化する）には高密度に存在していました。さらに、マウス同様にヒトの点変異は、LADにおいて高密度であることも分かりました （図1） 。

また、ヒトの疾患に関連する一塩基多型（SNP）のデータを用いて、SNPの分布を解析したところ、タンパク質をコードする遺伝子領域およびプロモーターやエンハンサーなどの遺伝子発現調節領域に高密度に存在することが分かりました。これは、iPS細胞における点変異とは逆の傾向を示しています （図2） 。

最後に、各エピゲノム領域においてみられたヒトiPS細胞の点変異のパターンを解析したところ、遺伝子発現調節領域ではトランジション型 の変異パターンが多くみられたのに対して、LADではトランスバージョン型の変異パターンが多くみられました （図3） 。トランスバージョン型優位の変異パターンは酸化ストレスによる変異パターンと一致しています。また、iPS細胞へのリプログラミングの初期段階で、ミトコンドリアにおける一時的な酸化的リン酸化 の上昇が報告されていることから、ミトコンドリアから酸化ストレスによる活性酸素が一過的に放出されると考えられます。

これらのことから、iPS細胞の樹立段階において、①細胞質内のミトコンドリアから活性酸素が一過的に放出される、②放出された活性酸素によって核内の核表面に近いLADに点変異が生じる、③LADにはDNAが高度に凝縮されておりDNA修復酵素が届きにくいため、点変異が高密度で蓄積する、というメカニズムが考えられました （図4） 。

図1　iPS細胞における点変異の分布
iPS細胞樹立時に生じる点変異の分布。染色体4番領域を例に示している。遺伝子密度の低い領域に核ラミナ結合領域（LAD）が存在し、この領域にホットスポット的にiPS細胞樹立時に生じた点変異が分布している。

図2　iPS細胞における点変異およびヒトの疾患に関連するSNPの分布パターン
iPS細胞樹立時に生じる点変異（左）とヒトの疾患に関連するSNPの分布（右）を示す。H3K4me1、H3K4me3、H3K27acのヒストン修飾されているゲノム領域やDNaseI高感受性領域（DHS）と呼ばれる開いたクロマチン領域にはプロモーターやエンハンサーといった遺伝子発現調節領域を含んでいるが、こうした領域にはiPS細胞樹立時に生じる点変異は低密度に存在する。一方で、H3K9me3のヒストン修飾されている転写不活性領域や核ラミナ結合領域（LAD）にはiPS細胞樹立時に生じる点変異は高密度に存在する。こうしたiPS細胞樹立時に生じる点変異の分布は、ヒトの疾患に関連するSNPの分布とは逆の傾向を示している。（*P < 0.05、** P = 1.3 × 10 ⁻⁸⁸ 、*** P << 1.0 × 10 ⁻²⁰⁰ ）

図3　iPS細胞樹立時に生じる点変異のパターン
DNaseI高感受性部位（プロモーターやエンハンサーといった遺伝子発現調節領域を主に含む領域）には全5,448個の変異の中で、合計88個の変異をトランジション優位に認めた。対して、LADには合計3,606個もの変異をトランスバージョン優位に認めた。（Ts：トランジション、Tv：トランスバージョン）

図4　iPS細胞樹立時に生じるゲノム変異のメカニズム
iPS細胞樹立時のリプログラミングの際に、①細胞質内のミトコンドリアから活性酸素が一過的に放出される、②放出された活性酸素によって核内の核表面に近いLADに点変異が生じる、③LADにはDNA修復酵素が届きにくいため点変異が高密度で蓄積する、というメカニズムが考えられる。

本研究では、iPS細胞の樹立時に生じる変異の大部分がDNAからRNAへの転写が抑制された領域に生じていることを解明しました。これは、iPS細胞のゲノム変異の多くは“良性の変異”であることを示唆しており、iPS細胞の臨床応用を加速する結果であると考えられます。しかし、大多数は転写が抑制された領域に生じていても、がん化などに直接的に影響を与える部位に変異が生じることも報告されていることから、引き続き慎重に安全性を評価することが重要です。

今後、iPS細胞の臨床試験例を積み重ね、ゲノムデータと臨床データを紐づけることで、これらのゲノム変異がもたらす影響について実証されると考えられます。iPS細胞のより深い科学的な知見に基づき、安全で有効な治療が展開されることが期待できます。

＜タイトル＞
Hotspots of de novo point mutations in induced pluripotent stem cells
＜著者名＞
Masahito Yoshihara, Ryoko Araki, Yasuji Kasama, Misato Sunayama, Masumi Abe,Kohji Nishida, Hideya Kawaji, Yoshihide Hayashizaki, Yasuhiro Murakawa
＜雑誌＞
Cell Reports
＜DOI＞
10.1016/j.celrep.2017.09.060