大阪大学大学院工学研究科の溝端栄一講師、高輝度光科学研究センターXFEL利用研究推進室の登野健介チームリーダー、理化学研究所放射光科学総合研究センターの岩田想グループディレクター等による国際合同研究チームは、X線自由電子レーザー（XFEL）施設SACLAを利用して、銅含有亜硝酸還元酵素の完全酸化型の立体構造を、銅原子の異常散乱効果 を用いて世界で初めて決定し、プロトン共役電子移動の反応機構を解明することに成功しました。

これまで、金属蛋白質の真の酸化型構造を知ることは、長い間、不可能とされてきました。本研究では、SACLAの実験技術の改良を進め、さらに、SACLAと大型放射光施設SPring-8 の技術を融合することで、新しい酵素反応機構を明らかにしました。

本研究成果により明らかとなった新しい生命化学反応プロセスの理解は、物質科学と生命科学と地球科学の分野をつなぐ架け橋となる発見であり、地球の窒素循環の制御につながる分野への応用展開を支える基盤となります。

本研究成果は、米国東部時間2016年2月29日（月）午後3時（日本時間3月1日（火）午前5時）、米国の科学誌「Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America（PNAS：米国科学アカデミー紀要）」に掲載されました。

SACLAで決定した亜硝酸還元酵素の亜硝酸イオンが結合した銅（Cu）活性中心の電子密度構造（上図）と、SPring-8で決定した構造との比較（下図）

プロジェクトを推進した阪大・溝端栄一講師（左）と理研・岩田想ディレクター（右）

窒素は生命を形づくる必須の元素です。地球上の窒素循環において、微生物は脱窒過程と呼ばれる重要な化学反応を銅含有亜硝酸還元酵素によって担います。本酵素は、亜硝酸イオン（NO ₂ ^- ）から一酸化窒素（NO）への一電子還元反応を触媒するタンパク質で、構造と機能が異なる2つの銅活性中心、“タイプ1銅”と“タイプ2銅”をもちます。タイプ1銅は他の電子供与タンパク質から電子を受容し、タイプ2銅はその電子を利用して亜硝酸還元反応を行います。銅活性中心の酸化型から還元型への変化は、配位構造の変化を引き起こし、効率的な電子伝達反応や酵素反応と結びついています。

金属蛋白質の真の酸化型構造を知ることは、長い間、不可能とされてきました。構造解明に必要なX線照射にともなう放射線損傷 により、金属中心がきわめて迅速に還元され、構造変化を誘起してしまうためです。しかし近年、Ｘ線自由電子レーザー（XFEL）を用いた新しい解析手法、連続フェムト秒結晶構造解析（SFX） の登場によって、常温状態かつ放射線損傷の無い状態（常温無損傷構造）の解明が可能になりつつあります。SACLAが生み出す10フェムト秒以下の極短パルス光を用いると、放射線損傷で構造変化が誘起されるよりも早く、構造情報を記録して観察することができます。

本研究では、実験技術の改良を進め、SFXと銅原子を用いたSADによる絶対構造決定法 を初めて実証し、銅含有亜硝酸還元酵素の正確な三次元構造を得ることに成功しました。さらに、SACLAの技術と大型放射光施設SPring-8の技術を融合することで、本酵素の真の酸化型構造情報から、生命現象を支える多くの酵素反応に共通する重要な生命化学反応プロセスであるプロトン共役電子移動の新しい知見を得ることに成功しました。

地球上の窒素循環において、土壌中や水中の窒素酸化物は、脱窒菌と呼ばれる微生物によって分子状窒素に還元され、大気中へと放出されています。土壌中の窒素含有量は植物の成長を決定する因子であるため、農作物の収穫量や食糧需給ひいては人口問題にとって重要です。一方、産業技術の発展による窒素化学肥料等の増加が微生物の脱窒作用を活性化し、窒素循環の均衡を破り、地球環境に多大な影響を与えていることが知られています。脱窒作用の詳細な理解は窒素循環の制御につながるため、それを担う微生物中の酵素の構造と機能を解明するための研究が注目を集めています。

本研究成果により明らかとなった酵素反応が担う新しい生命化学反応プロセスの理解は、物質科学と生命科学と地球科学の分野をつなぐ架け橋となる発見であり、地球の窒素循環の制御につながる分野への応用展開を支える基盤となります。

＜掲載論文＞
本研究成果は、米国東部時間2016年2月29日午後3時（日本時間2016年3月1日午前5時）、米国の科学誌「Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America（PNAS：米国科学アカデミー紀要）」に掲載されました。
論文情報:
Redox-coupled proton transfer mechanism in nitrite reductase revealed by femtosecond crystallography.
Yohta Fukuda, Ka Man Tse, Takanori Nakane, Toru Nakatsu, Mamoru Suzuki, Michihiro Sugahara, Shigeyuki Inoue, Tetsuya Masuda, Fumiaki Yumoto, Naohiro Matsugaki, Eriko Nango, Kensuke Tono, Yasumasa Joti, Takashi Kameshima, Changyong Song, Takaki Hatsui, Makina Yabashi, Osamu Nureki, Michael E. P. Murphy, Tsuyoshi Inoue, So Iwata and Eiichi Mizohata. PNAS (2016).

＜研究支援＞
本研究は、文部科学省X線自由電子レーザー重点戦略研究課題「創薬ターゲット蛋白質の迅速構造解析法の開発」と日本学術振興会の科学研究費補助金「光感受性化学構造をもつ金属蛋白質のX線自由電子レーザーを用いた常温無損傷構造解析」（15K18487）と新学術研究領域「感応性化学種が拓く新物質科学」と創薬等支援技術基盤プラットフォームの支援により行われました。また、本研究におけるデータ解析では、SACLAに併設されたスーパーコンピュータシステム「ミニ京」とHPCシステムを利用しました。

＜研究メンバー＞
本研究は、大阪大学大学院工学研究科の溝端栄一講師、カメン・チェ博士前期課程学生、井上豪教授、同蛋白質研究所の鈴木守准教授、米国コロンビア大学の福田庸太博士研究員（元大阪大学大学院工学研究科博士後期課程学生）、東京大学大学院理学系研究科の中根崇智研究員、カナダブリティッシュコロンビア大学のマイケル・マーフィー教授、高輝度光科学研究センターXFEL利用研究推進室の登野健介チームリーダー、理化学研究所放射光科学総合研究センターXFEL研究開発部門ビームライン研究開発グループの矢橋牧名グループディレクター、同利用技術開拓研究部門SACLA利用技術開拓グループの岩田想グループディレクター等による国際合同研究チームにより行いました。