大阪大学微生物病研究所の増子大輔助教、伊川正人教授らの研究グループは、脂質ナノ粒子（LNP）を用いて、精子を造れない男性不妊モデルマウスの治療に成功しました。

精液中に精子が存在しない状態を無精子症と呼び、閉塞性無精子症と非閉塞性無精子症に大別されます。閉塞性無精子症の場合、精巣で造られた精子を運ぶ管に異常があるため、管の再構成や、精巣精子を用いた顕微授精によって治療が可能です。一方、非閉塞性無精子症はそもそも精子形成に問題があるため、精巣内にも精子が認められず、治療法がありませんでした。

今回、伊川教授らの研究グループは、LNPを用いて、精巣の精細胞にmRNAを導入する技術を開発しました（図１）。次に、精子形成に必要なPdha2遺伝子（DNA）を欠損しているために精子を全く造れない非閉塞性無精子症モデルに対し、LNPによりPdha2のmRNA（DNAではない）を補充することで、精子を造らせることに成功しました。さらに、得られた精巣精子を顕微授精することで、産仔を得ることにも成功しました。パートナー（卵）から正常な染色体を受け継ぐだめ、生まれた子マウスは健康に育ち、オスであってもメスであっても次世代の子供を得ることができました。

本研究成果は男性不妊の中でも治療法のなかった非閉塞性無精子症が、mRNA補充により治療できる可能性を示したものであり、安全性試験を経てヒト患者への応用が期待されます。

本研究成果は、米国科学誌「Proceedings of the National Academy of Sciences（PNAS）」に、10月14日（火）午前4時（日本時間）以降に公開されました。

図1. 非閉塞性無精子症(NOA)モデルの治療戦略
NOAモデルマウスの精巣にLNPを用いてｍRNAを補充し、精子形成を進行させ、顕微授精を行い、産仔を獲得した。

不妊はカップルの約６組に１組にみられ、大きな社会的課題となっています。不妊の原因の約半数は男性に起因し、その多くは精子形成に異常が認められます。精子が存在すれば顕微授精が可能ですが、重度の非閉塞性無精子症では精子が存在せず、顕微授精を行うことができません。そのため、精子形成期の精細胞を標的とした新たな治療戦略の開発が求められています。従来法として、ウイルスベクターの利用がありますが、ウイルスだけでなく細胞由来成分が含まれるために遺伝子組み換えのリスクや安全性に課題があり、臨床応用には限界があります。一方、近年COVID-19ワクチンを契機に、LNPによるmRNA導入技術が注目されています。mRNAを内包するLNPは、試験管内で完全合成することができることから、細胞由来成分などは含まず、またDNAを含まないためにゲノムへの遺伝子導入リスクはありません。このように安全性の高いLNPを用いて、精子形成に必須な遺伝子機能をmRNAで補充できれば、遺伝子変異による男性不妊の治療につながるのではないかと考え、研究を開始しました。

発見１: LNPを用いた精巣へのmRNA伝達と、精細胞への優位性発現誘導
研究グループはまず、LNPを精巣に注入し、精巣内のどの細胞にmRNAを導入できるのかを検証しました。精細胞のみが緑色に光る遺伝子改変マウスに、赤色蛍光タンパクmScarletをコードするmRNAを封入したＬＮＰを注入すると、緑色と赤色がともに光る細胞と、赤色のみが光る細胞がありました（図２）。これは、LNPが生殖細胞である精細胞と、体細胞であるセルトリ細胞の両方にmRNAを導入できることを示します。

つまり、LNPが精細胞とセルトリ細胞の両細胞にアクセスして治療できる可能性を示します。しかしその一方で、精細胞を治療するためのmRNAがセルトリ細胞に導入されて、予期しない異常が起こる可能性も否定できません。そこで、セルトリ細胞で高発現するマイクロRNA（miRNA）であるmiR-471の標的配列を、mRNAの非翻訳領域に導入し、発現抑制することを考えました。予想通り、標的配列を付加したEGFP mRNAを導入した時には、セルトリ細胞のシグナルが減弱し、生殖細胞に偏った発現を実現しました（図３）。

図2. LNPは精細胞とセルトリ細胞の両方に導入される
マウスの精巣にLNPを用いてｍRNA(赤)を導入すると、生殖細胞（緑と赤）、セルトリ細胞（赤）の両方に導入された。

図3. miRNA標的配列を用いた生殖細胞に偏った発現を実現
左は戦略図で右は結果。セルトリ細胞で高発現するmiRNAの標識配列をmRNAの非翻訳領域に付加することで、セルトリ細胞での発現が抑制された（右下）。これで生殖細胞のみをターゲットにすることができる。

発見２: 非閉塞性モデルマウスへのｍRNA補充療法により産仔を得ることに成功
非閉塞性無精子症のモデルマウスとして、Pdha2 欠損マウスを用いました。Pdha2 欠損マウスは、減数分裂の進行が停止し、精子を全く造ることができず、完全な雄性不妊を示します。私たちは、Pdha2のmRNAを封入したLNPを精巣に注入しました。その結果、それまで停止していた減数分裂が再開しました（図４）。さらに、導入して３週間後に精巣内に精子を見つけました（図５左）。その精子を用いて顕微授精を行ったところ、産仔を得ることに成功しました（図５右）。Pdha2遺伝子の変異は、ヒト非閉塞性無精子症患者でも見つかっており、我々の手法を用いることで将来ヒト患者も児を得られる可能性があります。

図4. LNP導入によって減数分裂が再開した

図5. 回収された精子（左）と顕微授精によって得られた産仔（右）

精巣に精子が見つからない非閉塞性無精子症は、顕微授精の対象とならず、児を得ることは不可能でした。一方、近年の研究から、精子形成不全の原因となる遺伝子がマウスや患者で次々と同定されています。本研究成果は、精子形成不全の原因遺伝子が特定できた非閉塞性無精子症であれば、mRNA補充により治療できることを示したものであり、男性不妊患者に福音をもたらす可能性を秘めています。