※インフルエンザ菌はインフルエンザウイルスとは異なる病原体です。

大阪大学産業科学研究所のMartijn Zwama（マータイン ズワーマー）特任助教（常勤）、西野邦彦教授らの研究グループは、細菌の多剤耐性 化に関与するRND型多剤排出ポンプ の進化的解析 を行い、インフルエンザ菌 がなぜβ-ラクタム系抗菌薬 に感受性を示すのかを明らかにしました。また、インフルエンザ菌に存在する薬剤排出ポンプ には、本菌の感染症治療に用いられるβ-ラクタム系抗菌薬を含め、幅広い薬剤を排出する能力が備わっていることを証明し、これが本菌における潜在的なリスクであることも明らかにしました。

さらに西野教授らの研究グループは、複数の細菌に存在する、数百個ものRND型薬剤排出ポンプを解析することで、初めてこれらポンプ間の系統発生に関する知見を得ることに成功しました。

インフルエンザ菌の多剤排出ポンプAcrB（AcrB-Hi）が、進化上、比較的古い排出ポンプであることを明らかにし、新しいポンプである大腸菌AcrB（AcrB-Ec）との機能を比較して解析を行いました。

近年、多剤排出ポンプによって引き起こされる多剤耐性菌を克服するために、様々な阻害剤 が開発されていますが、本研究成果から考えられることは、これら阻害剤が、例えば、進化的に古いインフルエンザ菌のポンプに効力を示さない等、全てのRND型の多剤排出ポンプを阻害できない可能性があることです。本研究では、排出ポンプAcrBに加えて、外膜タンパク質 OmpP2との組み合わせで、インフルエンザ菌のβ-ラクタム系抗菌薬感受性が決定されていることを分子的に説明しており、本成果は、新たな知見を提供するものです。

数百種類にもおよぶ排出ポンプの系統解析は、これまでに研究されていなかった他の細菌や生物に存在する排出ポンプの機能と分類を予測するのにも役立つと考えられます。細菌における抗菌薬の薬物動態 および、進化を含む多剤排出ポンプによる分子防御機構に関する知識は、新規抗菌薬の開発と多剤耐性細菌を克服するために重要なものです。

本研究成果は、英国科学誌「Communications Biology」に、9月13日（金）午後6時（日本時間）に公開されました。

インフルエンザ菌b型（Hib）は、臨床的に問題となっている病原細菌であり、今日、抗菌薬に耐性を示す細菌の出現が、世界中で、人の健康の脅威となっています。細菌多剤耐性化機構の1つとして、RND型排出ポンプの存在があり、このポンプは、多くの構造的に関連性のない抗菌薬や毒物を排出します。

西野教授らの研究グループは、インフルエンザ菌の多剤排出ポンプAcrB（AcrB-Hi）が、進化上、比較的古い排出ポンプであることを明らかにし、新しいポンプである大腸菌AcrB（AcrB-Ec）との機能を比較して解析を行いました （図1） 。AcrB-Hiは、AcrB-Ecから系統的に離れているにもかかわらず、Hib感染症治療に用いられるβ-ラクタム系抗菌薬を含め、AcrB-Ecと同様に幅広い薬剤を排出する能力が備わっていることを実験的に証明しました。すなわち、RND型ポンプにみられる多剤排出能は進化的に獲得されたものではない可能性があり、古来、この能力が備わっていたことが示唆されます。

進化したAcrB-Ecには、薬物結合ポケットにアミノ酸であるフェニルアラニンに富んだ疎水性トラップがあり、これはAcrB-Hiにはない特徴です （図2） 。西野教授らは、排出ポンプ阻害剤であるABI-PPがこのトラップに強く結合して、フェニルアラニン残基と強く結合することを以前に発見しましたが(Nature 1;500(7460),2013)、本研究で、AcrB-Hiは阻害剤によって機能が抑制されないことが分かりました。また、AcrB-Ecは抗菌薬排出に加え、非常に効率的に胆汁酸塩も排出しますが、AcrB-Hiの胆汁酸排出能力はとても低いものであり、このことから、大腸菌が生息する胆汁酸塩が富んだ環境に適合するためにポンプも適応したことが示唆されます。

次に、AcrB-Hiが多くのβ-ラクタム系抗菌薬を効率的に排出するにも関わらず、なぜ、インフルエンザ菌がβ-ラクタム系抗菌薬に感受性を示し、本薬による治療が効果的であるのか、その理由を明らかにしたいと考えました。その結果、口径が広い外膜タンパク質OmpP2がインフルエンザ菌に存在することが、その理由であることが分かりました。OmpP2が存在することにより、β-ラクタム系抗菌薬はより効率的にインフルエンザ菌の中に流入し、この効率的な流入がAcrB-Hiポンプによる能動的排出を相殺していることが分かりました。

本研究における実験結果から、RND型排出ポンプによる多剤排出能は古来備わっているものであることが考えられます。AcrB-Ecは進化して、ピット がよりフェニルアラニンが富んだ状態になり、より効率的で特異的なポンプとなったと考えられますが、その結果、阻害剤によって機能が抑制されることになったことは、細菌にとって不利な予期せぬ進化の結果であったことが示唆されます。将来的にAcrB-Hiポンプが過剰発現し、外膜タンパク質OmpP2の変異や発現の低下により、現在β-ラクタム系抗菌薬に感受性であるインフルエンザ菌Hib株が多剤耐性化して臨床的に問題になる可能性があります。

図1　RND型多剤排出ポンプの系統樹。
クラスター毎に青色で表示しており、その中に存在するサブクラスターは濃い青色で示す。インフルエンザ菌AcrBポンプ（AcrB-Hi）は左側に存在しており、大腸菌AcrB（AcrB-Ec）は右に位置している。

図2　進化したAcrB-Ec（大腸菌ポンプ）に存在するフェニルアラニン残基に富んだ領域と系統的に古いAcrB-Hi（インフルエンザ菌ポンプ）との比較.
AcrB-Ecにはこの領域にフェニルアラニンが6個存在しているのに対して、AcrB-Hiには1個しか見当たらない。

本研究によって、病原細菌であるインフルエンザ菌に存在するRND型薬剤排出ポンプによって多剤耐性化が引き起こされる潜在的リスクが明らかになりました。本病原細菌は、特に乳幼児に対して、髄膜炎や肺炎など重篤な症状を引き起こすことがあり、世界的に問題となっています。インフルエンザ菌の潜在的な多剤耐性因子や薬剤排出ポンプの進化を理解することは、新規抗菌薬の開発にとって重要なものです。

図3　大腸菌とインフルエンザ菌における薬剤排出ポンプとポリン（外膜タンパク質）の相互作用。
AcrBポンプは、ペリプラズムと細胞質から抗菌薬を能動的に排出し、細胞内の抗菌薬濃度を低下させることで、それらの菌に対する効力を弱めることができる。大腸菌ポンプAcrB-Ecは、大腸菌の生育環境である腸内に存在する物質である胆汁酸塩を排出することができるが、インフルエンザ菌ポンプAcrB-Hiは胆汁酸塩をほとんど排出できない。排出ポンプ阻害剤ABI-PPはAcrB-Hiを阻害できないが、AcrB-Ecの排出能力を完全に阻害する。インフルエンザ菌に存在する口径が広い外膜タンパク質OmpP2は、β-ラクタムやノボビオシン等の小さい抗菌薬を細胞内に流入させ、インフルエンザ菌はこれらの抗菌薬に感受性を示す。

これまで、大腸菌のAcrB多剤ポンプは、RND型ポンプによる細菌の多剤耐性化を理解するためのモデルとして研究が進められてきました。しかし、他の細菌種におけるRND型ポンプについては、情報が少ないものが多く、さらに、これらポンプの進化と遺伝的関連をより理解するための系統解析の報告例は極めて少なく、まだ完全に理解されていませんでした。本研究で行われた数百種におよぶポンプの系統解析は、他の細菌や生物種に存在する未知のポンプをより簡便に分類するためのツールとして役立ちます。また、RND型ポンプは通常、多剤耐性因子として単一的に解析が行われる例が多いですが、細菌薬剤感受性を決める薬剤の細菌内濃度は、ポンプによる能動的排出と膜バリア機能の両方の影響を受けます。したがって、細菌の薬剤耐性化を理解するためには、排出ポンプと外膜ポリンの両方を組み合わせて調べることが重要であることが分かりました。さらに、RND型多剤排出ポンプは、進化の過程で複数の抗菌薬を認識できる能力を持った訳ではなく、古来、この機能はポンプに存在していたことが示唆されます。他の細菌種に存在するより多くの排出ポンプを研究して、それらの系統発生的関係と機能をより理解した上で、分子レベルで細菌多剤耐性を克服することを目指しています。

本研究成果は、9月13日（金）午後6時（日本時間）に英国科学誌「Communications Biology」（オンライン）に掲載されました。

タイトル：“Phylogenetic and functional characterisation of the Haemophilus influenzae multidrugefflux pump AcrB”
著者名：Martijn Zwama, Akihito Yamaguchi and Kunihiko Nishino
DOI：10.1038/s42003-019-0564-6