大阪大学大学院医学系研究科附属動物実験施設の真下知士（ましも ともじ）准教授、情報・システム研究機構国立遺伝学研究所マウス開発研究室の吉見一人（よしみ かずと）助教らの研究グループは、ゲノム編集技術‘CRISPR/Cas システム’と一本鎖オリゴ（ssODN）を利用する二つの新しい遺伝子改変技術の方法（「ｌｓODN(長鎖一本鎖DNA)法」 と「2H2OP(2ヒット2オリゴ)法」 （図1） ）を開発しました。

‘CRISPR/Casシステム’は、マウスやラットにおける新しい遺伝子改変技術として注目されている技術です。DNAを切断する酵素Cas9と、ゲノム上の編集箇所を見つけ出すgRNAを動物の受精卵に注入することで、特定の遺伝子を破壊（ノックアウト）したり、特定の箇所へ導入（ノックイン）することができます。しかしながらこれまで動物の受精卵では、遺伝子などの大きなDNA配列の導入効率が低く、ノックイン動物を作製することが困難でした。

本研究で開発した二つの新しい遺伝子改変技術の方法により、GFP遺伝子 の効率的かつ正確なノックインに加え、これまで不可能だった大きなサイズのゲノム領域（約200 kbp）の導入、ラット遺伝子のヒト由来遺伝子への置き換え（遺伝子ヒト化動物）に成功しました （図2） 。

今後、これら二つのノックイン法は、マウスやラットなどのみならず様々な生物種における遺伝子改変操作の効率を向上させ、新しい遺伝子組み換え生物の作製に非常に有用な技術になることが期待されます。また、作製された遺伝子改変動物は、創薬研究、トランスレーショナル研究、再生医療研究などへの幅広い利用が期待されます。

本研究成果は、平成28年1月20日（水）に英国ネイチャー出版グループ オープンアクセス誌「Nature Communications」から公開されました。

図1　2H2OP法の略図
一本鎖DNA（ssODN）を‘のり’として利用することで、プラスミドを標的部位へ効率的にノックインできる。

図2　2H2OP法により作製されたGFPノックインラット。
ノックイン個体は全身で緑色蛍光タンパク質を発現するため、全身が緑色の蛍光を発する。

CRISPR/Casの登場により、マウス、ラットなどにおける遺伝子改変が簡単になりました。動物の受精卵にCas9のメッセンジャーRNAとgRNAを導入することで、gRNAが標的となるDNA配列を認識し、Cas9がその標的部位を切断します。切断されたDNA部位は非相同末端結合（non-homologous end joining）により修復されますが、その際に、DNA変異が導入されることで、遺伝子を破壊（ノックアウト）できます。また、Cas9/gRNAと一緒に、ドナーDNAとなる一本鎖オリゴ（ssODN）を導入すると、ドナーDNAを利用した相同性修復（homology-directed repair)により切断部位が修復され、1～数十塩基（bp）のDNA配列を導入（ノックイン）することができます。しかしながら、これまでssODNは200bp程度までしか合成できず、そのためssODNを用いてGFPなどの大きなサイズのDNA配列をノックインすることが困難でした。一方、より長い配列を保持できるDNAプラスミドをドナーDNAとして用いた場合、受精卵では相同組換え効率が低いため、プラスミドDNAをノックインすることが困難でした。

本研究の成果は以下になります。
1) Cas9発現プラスミドのターミネーター配列にポリアデニン鎖polyAを付加することで、受精卵でのCas9タンパク質の発現が上昇しました。このCas9-polyAを利用して、受精卵でのゲノム編集効率を向上させることができました。
2) バイオダイナミクス研究所との共同研究により、長鎖の一本鎖DNA（lsODN）の作製方法を新たに開発し、lsODNをドナーDNAとして用いることで効率的および正確にGFP配列をノックインすることに成功しました。
3) CRISPR/Casシステム（Cas9 mRNA、二つのgRNA）を‘はさみ’として、一本鎖DNA（ssODN）を‘のり’として利用する方法（2ヒット2オリゴ法：2H2OPと命名）を開発し、CAG-GFP配列5.5 kbpのプラスミドを標的部位へ効率的にノックインしました。
4) この2H2OP法を利用することで、これまでノックインが不可能だった大きなサイズ（200-kbp）であるBACプラスミド （ヒトSIRPA遺伝子配列全体を含む）をノックインすることに成功しました。
5) 最後に、三つのgRNA を利用する3H2OP法により、DNA切断部位を増やすことで、ラット Cyp2d クラスター遺伝子座58kbpをヒト CYP2D6 遺伝子6.2kbpに置換することに成功しました。

今回、CRISPR/Casシステム と一本鎖オリゴを組み合わせることで大きなサイズのDNA配列を効率的にノックインする二つの新しい方法（lsODN法と2H2OP法）を開発しました。1) lsODNを利用することで、GFPやDsRedなどのレポーター遺伝子を正確にノックインできるため、マウスやラットの遺伝子を標識することができるようになりました。2) 2H2OP法を利用することで、これまで不可能であったBACプラスミドのノックイン、遺伝子クラスターを含むDNA領域の置換などが可能になりました。例えば、マウスやラットの遺伝子をノックアウトすると同時に、ヒト遺伝子をノックインした「遺伝子ヒト化動物」 の作製が可能です。

今回の新しいノックイン技術は、マウスやラットなど様々な動物における遺伝子改変操作の効率を向上させるとともに、作製された遺伝子改変動物は、創薬研究、トランスレーショナル研究、再生医療研究などに幅広く利用されることが期待されます。

<研究助成>
本研究の一部は、以下の事業の助成を受けて実施されました。

・独立行政法人日本学術振興会 科学研究費助成事業（基盤研究(B)）
「実験用ラットにおけるゲノム編集基盤技術の開発」（課題番号：26290033、代表：真下知士）

・独立行政法人日本学術振興会 科学研究費助成事業（研究活動スタート支援）
「CRISPR/Cas9を用いた多重遺伝子ノックアウトラット作製技術の開発」（課題番号：25890011、代表：吉見一人）

<掲載論文>
‘ssODN-mediated knock-in with CRISPR-Cas for large genomic regions in zygotes’
「CRISPR-Casシステムと一本鎖オリゴによる受精卵での大きなゲノム領域のノックイン」
Kazuto Yoshimi ^1,2 , Yayoi Kunihiro ^1,3 , Takehito Kaneko ¹ , Hitoshi Nagahora ⁴ , Birger Voigt ¹ and Tomoji Mashimo ^1,3
吉見 一人 ^1,2 、国広弥生 ^1,3 、金子武人 ¹ 、長洞仁 ⁴ 、フォークト ビルガー ¹ 、真下知士 ^1,3
1 Institute of Laboratory Animals, Graduate School of Medicine, Kyoto University, Kyoto 606-8501,
² Mouse Genomics Resource Laboratory, National Institute of Genetics, Shizuoka 411-8540,
³ Institute of Experimental Animal Sciences, Graduate School of Medicine, Osaka University, Osaka 565-0871,
⁴ BioDynamics Laboratory Inc., Tokyo 113-0033, Japan
¹ 京都大学大学院医学研究科附属動物実験施設
² 国立遺伝学研究所系統生物研究センターマウス開発研究室
³ 大阪大学大学院医学系研究科附属動物実験施設
⁴ 株式会社バイオダイナミクス研究所

DOI番号：10.1038/NCOMMS10431
Nature Communications： http://www.nature.com/naturecommunications

論文掲載先（Nature Communications (DOI:10.1038/NCOMMS10431)）
http://www.nature.com/ncomms/2016/160120/ncomms10431/full/ncomms10431.html

大阪大学大学院医学系研究科実験動物学 真下研究室
http://www.iexas-osaka-u.jp/lab/

研究内容（大阪大学大学院医学系研究科・医学部ＨＰより）
http://www.med.osaka-u.ac.jp/jpn/activities/research/shisetsu.html#R02