本研究成果は、細胞極性 を決める基本原理を説明するとともに、細胞運動 を操作する技術への応用や、がん細胞が浸潤、転移する仕組みの理解につながると期待できます。

運動する細胞の細胞膜上では、進行方向に対して前側には脂質分子PIP ₃ が、後側にはその分解酵素であるPTEN が、空間的に分離して存在しています。細胞が効率良く運動するには、細胞の前後領域が明確に区別される必要がありますが、PIP ₃ とPTENの細胞膜上での分布がなぜ混じり合わないのかはよく分かっていませんでした。

今回、研究チームは、生きている細胞の中の1個の分子を観察する「1分子イメージング法 」を用いて、細胞の前後を決める分子の動きを解析しました。その結果、PIP ₃ とPTENが互いに抑制し合う働きによって、細胞膜上での分布が混じり合わず、前後の領域の境界が明確になることが分かりました。この発見から、細胞の運動に方向性を与える酵素-基質システムの存在が明らかになりました。

本研究は、米国の科学雑誌『Nature Communications』オンライン版（10月26日付け：日本時間10月26日）に掲載されました。

図1　細胞膜上の2分子が細胞の前後を決める

細胞の重要な機能の一つに細胞運動があります。例えば、けがをすると血液の中の白血球が体内を移動して傷口に集まります。白血球が血管の壁を這うように動くとき、細胞の進行方向側では細胞膜を押し出す力により仮足 が伸び、反対側では細胞を縮める力が働きます。このように、相反する力を細胞の両端で発生させる必要があることから、細胞が動き始めるときには、どちらが前でどちらが後ろかが明確に決まっていると考えられます。しかし、細胞の前後を決める仕組みは完全には分かっていません。

先行研究から、真核生物の細胞では、細胞膜上に存在する脂質分子PIP ₃ とその分解酵素PTENの量によって、前と後ろが決まることが知られていました 注1，注2) 。正常な細胞では、細胞膜は「PIP ₃ が蓄積した領域（PIP ₃ ドメイン）」と「PTENが蓄積した領域（PTENドメイン）」の二つの領域に明確に分けられ、細胞の前側にPIP ₃ ドメインが、後側にPTENドメインができます。もしPIP ₃ とPTENが互いに独立した仕組みで蓄積するならば、ニつのドメインが重なり合い、前側でも後側でもある場所ができる可能性があります。しかし、実際にはそのような現象は観察されず、PIP ₃ ドメインとPTENドメインは細胞膜上で互いに分離しています。したがって、PIP ₃ とPTENの間には何らかの相互作用が働いて、それぞれの蓄積を排他的にしていると考えられますが、その仕組みは不明でした。

研究チームは仮説として、「PTENが増えればPIP ₃ の蓄積が抑制され、PIP ₃ が増えればPTENの蓄積が抑制される」のではないかと考えました。つまり、いったん後側になると周囲が前側にならないように、逆に、いったん前側になると周囲が後側にならないようにする仕組みがあれば、前後どちらともいえない場所ができるのを避けることができます。しかし、PIP ₃ はPTENが触媒する酵素反応の基質であり、基質がたくさんあるのに酵素がその周囲に蓄積しないというのは直感に反します。また、通常の光学顕微鏡を用いた場合、観察できるのはPIP ₃ ドメインやPTENドメインができた後の現象のため、二つのドメインができる過程で鍵となる分子の振る舞いを詳しく調べることは困難でした。

研究チームは、まず「PTENが増えるとPIP ₃ の蓄積が抑制される（あるいは、PTENが減るとPIP ₃ の蓄積が促進される）」かどうかを調べました （図2） 。真核生物である細胞性粘菌 の細胞の中では、細胞性粘菌が元々持っているPTENは細胞膜に蓄積しますが、ヒトのPTENはこれに比べて蓄積量が少ないことが分かっています。そこで、遺伝子組換えにより、細胞性粘菌のPTENをヒトのPTENに交換したところ、細胞の前側になるPIP ₃ ドメインが広がって（PIP ₃ の蓄積が促進され）、PTENドメインとの境界が曖昧になりました。これによって運動方向が定まりにくくなり、運動速度が低下しました。つまり、十分な量のPTENが細胞膜に蓄積することでPIP ₃ の細胞膜への蓄積を抑制し、前側領域だけに限定すると考えられます。

図2　PTENによるPIP ₃ ドメインの制御
細胞性粘菌のアメーバ細胞における、PIP ₃ ドメインとPTENドメインの同時イメージング。PIP ₃ に結合するタンパク質PH-GFP（緑色蛍光タンパク質）と、PTENとHaloTagタンパク質との融合タンパク質（赤色蛍光色素を結合）を用いて、細胞膜上のPIP ₃ ドメインとPTENドメインを顕微鏡によって観察した。PIP ₃ ドメインの位置に基づく運動方向を矢印で示した。スケールバーは10マイクロメートル（μm、1μmは1,000分の1mm）。

左：細胞性粘菌が元々持っているPTENを発現している細胞では、細胞膜（細胞の周囲の領域）に赤あるいは緑の蛍光が観察される。前側にあるPIP ₃ ドメインと側面を含む後側にあるPTENドメインは、空間的に分離しており重ならない。
中：PTENの酵素活性を欠損した細胞では、PIP ₃ ドメインが細胞膜全体に広がり、PTENドメインと重なる様子が観察された。
右：ヒトPTENを発現している細胞では、PIP ₃ ドメインが広がってPTENドメインとの境界が曖昧になった。これにより前側領域が広がったため、細胞が前進しようとすると、運動方向が定まらない様子が観察された。

次に、これとは反対に「PIP ₃ が増えるとPTENの蓄積が抑制される」かどうかを調べました。遺伝子組換えと薬剤処理を利用することで、顕微鏡観察の最中に細胞内のPIP ₃ 合成活性を操作することができます （図3） 。PIP ₃ 合成活性の強さを徐々に大きくしていったところ、合成活性が低いときには、少し活性を上げてもPIP ₃ 量は変化しませんでしたが、合成活性が中程度のときには少し合成活性を上げただけで、PIP ₃ が一挙に蓄積しPIP ₃ ドメインが出現しました。さらに合成活性を上げていくと、PIP ₃ ドメインの面積が広がりましたが、ドメイン内の各地点のPIP ₃ 蓄積量は変化しませんでした。一方でPTENは、PIP ₃ が蓄積しなければ細胞膜に蓄積し、PIP ₃ が蓄積するとその細胞膜領域では蓄積しなくなるという、PIP ₃ とはちょうど反対の変化を示しました。

つまり、「PIP ₃ は蓄積せずPTENが蓄積している状態」と「PIP ₃ が蓄積しPTENは蓄積していない状態」が、スイッチが切り替わるように変化することが分かりました。こうした性質は双安定性 と呼ばれています。双安定性の成立には正常なPTENの機能が必要であり、ヒトPTENに交換した細胞では、スイッチのように切り替わらずPIP ₃ がゆっくりと蓄積するようになりました。そのため、この細胞ではPIP ₃ ドメインが広がって境界が曖昧になったと考えられます。このように、双安定性があることで前後が明確に分離し正常に運動できるようになることが示されました。

さらに、他の遺伝子操作による方法を用いてPIP ₃ 蓄積量を増やした実験でも、PTEN蓄積量の減少が確認できました。これらの結果から、PIP ₃ はPTENの細胞膜への蓄積を抑制すると結論づけました。つまり、「PIP ₃ とPTENは、細胞膜上での量を相互に抑制し合う関係（相互抑制関係）にある」ことが明らかになりました。

図3　PIP ₃ とPTENの相互抑制関係
異なる濃度のPIP ₃ 合成阻害剤を細胞性粘菌に添加することで、内在のPIP ₃ 合成活性の強さを操作することができる。細胞の外形の影響を排除するため、薬剤処理により細胞骨格を壊したため円形の細胞となっている。 図2 と同様に、PIP ₃ ドメインを緑色で、PTENドメインを赤色で蛍光顕微鏡観察した

上：PIP ₃ 合成活性の操作実験。細胞内のPIP ₃ 合成活性を徐々に上げていき、細胞膜に蓄積するPIP ₃ およびPTENを同時にイメージングした。PIP ₃ 合成活性が低いときには、少し活性を上げても（40μMから16μM）細胞膜のPIP ₃ 量は変化しない。合成活性が中程度のときに少し活性をあげると一挙にPIP ₃ ドメインが出現し（16μMから4μM）、さらに上げるとPIP ₃ ドメインが細胞膜全体に拡大した（4μMから2μM）。合成活性が高いときには、少し活性を上げてもPIP ₃ 量は変化しなかった（2μMから1μM）。一方でPTENは、PIP ₃ が蓄積しなければ細胞膜に蓄積し（40μMから16μM）、PIP ₃ が蓄積するとその細胞膜領域には蓄積しないようになった（4μMから1μM）。
下：PIP ₃ /PTEN蓄積量の計測。PIP ₃ 合成活性の操作前後で、細胞膜上のPIP ₃ （縦軸）およびPTEN(横軸)の蛍光強度を計測した。操作前（40μM）には細胞膜全体が高PTEN・低PIP ₃ 状態をとるが、操作後（1μM）には細胞膜全体が低PTEN・高PIP ₃ 状態になった。

次に、基質であるPIP ₃ の蓄積がその分解酵素であるPTENの蓄積を抑制する仕組みを明らかにするために、1分子イメージング法を用いて細胞膜とPTENとの相互作用について定量的に解析しました （図4） 。PTENの細胞膜結合時間を計測すると、PIP ₃ が蓄積していなければ平均4.6秒であるのに対し、蓄積していると1.7秒にまで短縮されていました。また、PTENの細胞膜へ結合する頻度も、PIP ₃ が蓄積していると半分に低下することが分かりました。

図4　細胞膜でのPTENの1分子イメージング解析
左：PTENの1分子イメージング画像。全反射蛍光顕微鏡を用いて細胞を下から観察した。細胞膜に結合しているPTEN-Halo-TMRの1分子が、一つの白い点として可視化されている。

右：細胞膜上を拡散するPTEN分子の軌跡。左画像における白い点の重心位置の時間変化の軌跡を計測した結果を線で表わす。PIP ₃ の蓄積がないとき（上段）に比べて高いときには（下段）、白い点が見えている時間が短くなっており、同じ時間内により遠くまで移動したことが分かる。これらは、PTEN分子の平均の細胞膜結合時間の短縮と拡散係数の増加を反映している。数字はその分子の細胞膜結合時間（単位：秒）を表す。

これらの結果は、PTENが細胞膜と結合するときの結合サイトをPIP ₃ が抑制する可能性を示しています。これについて、1分子のPTENの動きをさらに詳しく解析して検証しました。PTENは、細胞膜に結合すると膜平面上を2次元的に拡散しますが、膜の脂質・タンパク質組成によって拡散する速さ（拡散係数 ）が異なります。研究チームは2013年に、独自に開発した1分子イメージングデータ統計解析法を用いて、PTENの拡散がどのように膜組成の影響を受けるかについて明らかにしていました 注3) 。同じように解析した結果、PTENがPIP ₃ の分解を触媒する反応と共役して、結合サイトから外れやすくなっていることが分かりました （図5上左） 。これは、PIP ₃ の蓄積が高く酵素反応が起こりやすいと、PTENが細胞膜に留まりにくいことを意味します。このため、基質であるPIP ₃ が酵素であるPTENの細胞膜への蓄積を抑制するようになると考えられます （図5上右，下） 。

図5　PTENの拡散解析結果と導き出された仕組み
上左：PTENの拡散状態の解析。PTENは拡散係数の異なる三つの細胞膜結合状態（低拡散・中拡散・高拡散）をとる。PIP ₃ 蓄積が低いときに比べて高いときには、拡散が最も遅い状態（低拡散）をとる分子数が減少する。

上右：1分子イメージング解析によって提案されるモデル。PTENの拡散が最も遅い状態をとるのに必要な膜への結合サイト（オレンジの楕円）がPIP ₃ によって抑制される（緑）。なおこの抑制は、PTENの酵素活性に依存した経路と依存しない経路の両方が関わっていること、および細胞性粘菌の走化性物質であるcAMP添加によっても起きることが、本研究の別の実験から分かった。
下：モデルから想定される、PIP ₃ PTENドメインとPTENドメインが分離する仕組み。PIP ₃ とPTENが互いに抑制し合う働きによって、細胞膜上での分布が混じり合わず、前後の領域の境界が明確になる。すなわち、細胞の前側では、PIP ₃ がPTENの細胞膜への結合サイトを抑制することで、PTEN蓄積が抑制される。細胞の後側では、PTENがPIP ₃ の蓄積を抑制することで、PTENが蓄積する。

本研究において細胞運動のモデルとして用いた細胞性粘菌は、特定の化学物質に対する走化性 を示すことが知られています。今回明らかとなったPIP ₃ とPTENのシステムは （図5） 、この走化性物質に対する刺激でも働くことから、環境に応じて細胞の前後を決定し、生存に適した環境へと移動するための生存戦略を知る重要な手掛かりになります。また、こうした仕組みに則って細胞の運動を人為的に操作する方法を開発できれば、がん細胞や免疫細胞の運動性を制御する新たな治療法の開発につながると期待できます。

本研究で用いた手法は、細胞性粘菌だけではなく、哺乳類の培養細胞など他の細胞システムにおいても、膜分子の空間パターンが形成される仕組みの解明に応用することができ、多様な生物において細胞の極性が形成される普遍的な仕組みの理解に役立つと期待できます。

タイトル：Mutual inhibition between PTEN and PIP ₃ generates bistability for polarity in motilecells
著者名：Satomi Matsuoka, Masahiro Ueda
雑誌：Nature Communications
DOI：10.1038/s41467-018-06856-0

本研究は、日本医療研究開発機構（AMED）「革新的先端研究開発支援事業（AMEDCREST）」の研究開発領域「画期的医薬品等の創出をめざす脂質の生理活性と機能の解明（研究開発総括：横山信治）」における研究課題「1分子・質量イメージング顕微鏡の開発と細胞膜機能解析（研究開発担当者：上田昌宏）」および日本学術振興会（JSPS）科学研究費補助金基盤研究C「細胞の前後極性のリポソーム内再構成（研究代表者：松岡里実）」による支援を受けて行われました。