大阪大学大学院工研究科の大洞光司助教および林高史教授らの研究グループは、兵庫県立大学大学院生命理学研究科 城宜嗣教授および理化学研究所放射光科学総合研究センター 杉本宏専任研究員と共同で、安定なC–H結合 を触媒的にC-OH結合に変換するマンガンポルフィセン とミオグロビン を複合化した人工酵素の反応活性種を観測し、マンガン5価オキソ種 であることを世界で初めて明らかにしました （図1） 。

これまで天然炭素資源等の利用において、炭素と水素の結合（C–H結合）は非常に安定であり、反応性が乏しく有用物質への変換において大きな問題となっていました。この安定なC–H結合を効率的にC-OH結合に変換する水酸化能を有する天然酵素が注目されてきましたが、その高い活性が理由で反応活性種の解明は困難と考えられており、酵素の反応メカニズムの解明やさらなる改良に重要であるにもかかわらず、活性種は非常に限られた系でしか解明されていませんでした。

今回、大洞助教、林教授らの研究グループは、活性種を得るためにストップトフロー法 という手法を用いて、安定なC–H結合を効率的にC-OH結合に変換するマンガンを含む人工酵素の活性種がマンガン5価オキソ種であることを世界で初めて同定しました。さらに得られる反応活性種が、天然酵素のような複雑なタンパク質環境を必要とせずに安定なC–H結合を室温で水酸化可能であることを示しました。これにより、今後の人工酵素の設計が可能になり、複雑な有機化合物の位置・立体選択的な水酸化や、豊富な天然炭素資源の有用物質への効率的変換に貢献します。

本研究成果は、米国科学雑誌「Journal of the American Chemical Society」に、2017年12月14日（米国東部時間）にオンライン公開されました。

図1　本研究の概念図。マンガンを含む錯体とタンパク質を組み合わせた人工酵素における活性種の観測と同定。

触媒は、通常では進行しない化学反応により原料物質を有用物質に効率的に変換する際に用いられる物質です。 さまざまな種類の触媒が存在し、代表的にはタンパク質から構成される酵素、金属個体の表面等を利用する固体触媒やナノメートル（10 メートル）サイズの分子触媒が挙げられます。本研究分野において、炭素と水素の安定な結合であるC–H結合の活性化を伴う物質変換は、多様な天然炭素資源から有用物質を生産する上で重要な反応として注目されています。特に天然酵素においては、室温付近の温和な条件下で安定なC–H結合を一つの酸素原子（O）を挟んだC-OH結合に変換するシトクロムP450 が広く研究されており、その反応の鍵となる活性種は鉄を含むヘム から電子が引き抜かれた高原子価種 であることが知られています。この活性種の反応性は非常に高く、固体触媒や分子触媒の活性種への応用が可能になれば有用ですが、通常は天然酵素の複雑なタンパク質内部でのみ容易に発現し、人工系への応用は非常に難しい課題です。一方、シトクロムP450と同じヘムを含むタンパク質であり単純な構造を有するミオグロビンは、同反応に対して触媒活性を全く示さないことが知られています。以前に、大洞助教、林教授らのグループでは、 図2 に示すように、ミオグロビン中のヘムを人工的に調製された金属錯体であるマンガンポルフィセンに入れ替えた人工酵素を調製したところ、はじめて、単純な構造のミオグロビンを用いて同反応が触媒的に進行することを報告しました（J. Am. Chem. Soc. 2013, 135, 17282–17285.）。しかし、ミオグロビンのような単純なタンパク質の内部で、どのようにして室温で安定なC–H結合の水酸化が可能になっているのか、反応活性種については明らかにされてきませんでした。

今回、大洞助教、林教授らの研究グループでは、ミオグロビンとマンガンポルフィセンを組み合わせた人工酵素について、基質（原料物質）の非存在化で、比較的強い酸化剤であるメタクロロ過安息香酸 等の過酸と反応させ各種分光法で観測・同定しました。具体的には、ストップトフロー法を用いて調製したサンプルの紫外可視近赤外光の吸収スペクトル測定と急速凍結法 を用いて調製したサンプルの電子スピン共鳴スペクトル測定 により、活性メカニズムにおける反応活性種がポルフィセンのマンガン5価オキソ種であることを解明しました。さらに、得られた活性種に基質を添加することで実際に水酸化反応が進行し、確かに触媒機構内の反応活性種であることを示しました。

図2　人工酵素調製の概念図。左上の構造はミオグロビンの結晶構造。

これまで安定なC–H結合を室温付近で選択的に水酸化する手法の一つとして、天然酵素による触媒的な水酸化が挙げられてきました。しかしながら、これらの天然酵素は複雑なタンパク質の環境が作用して、特定の基質にのみ高い活性を示す特徴があり、他の基質の水酸化に応用することは非常に困難です。一方、ミオグロビンとマンガンポルフィセンを組み合わせた人工酵素は様々な基質に対して適応可能であり、本研究成果において、反応活性種がマンガン5価オキソ種であることが実験的に証明されました。この知見は、安定なC–H結合活性化の詳細なメガニズム解明を可能にし、計算化学と組み合わせた合理的な人工酵素の設計に応用でき、今後、単純な分子触媒や固体触媒では不可能な複雑な有機化合物の位置・立体選択的な水酸化や豊富な天然炭素資源の有用物質への効率的な変換に貢献します。また固体触媒や分子触媒の活性種と今回の活性種は類似する部分も多く、今回発見された室温付近で高い活性を示すマンガン5価オキソ種は、天然酵素のような複雑なタンパク質環境も不要であり、固体触媒や分子触媒の系の発展にも寄与すると期待されます。

本研究成果は、2017年12月14日（米国東部時間）に米国科学雑誌「Journal of the American Chemical Society」（オンライン）に掲載されました。

タイトル：“Manganese(V) Porphycene Complex Responsible for Inert C–H Bond Hydroxylation in a Myoglobin Matrix”
著者名：Koji Oohora, Hiroyuki Meichin, Yushi Kihira, Hiroshi Sugimoto, Yoshitsugu Shiro and Takashi Hayashi
DOI: 10.1021/jacs.7b11288

なお、本研究は、科学技術振興機構（ＪＳＴ）戦略的創造研究推進事業個人型研究（さきがけ）「革新的触媒の科学と創製」および文部科学省科学研究費補助金新学術領域研究「高難度物質変換反応の開発を指向した精密制御反応場の創出」の支援を受けて行われました。