2014年12月19日

リリース概要

大阪大学免疫学フロンティア研究センターの前田優香博士、西川博嘉特任准教授、坂口志文教授らの研究グループは、CD4陽性制御性T細胞が自己免疫反応(自己免疫疾患)を回避するために自己に反応するCD8陽性T細胞に安定的な免疫不応答状態(アネルギー)を誘導することを明らかにしました。また従来フェノタイプが明らかにされてこなかったアネルギー細胞が持つ特徴的なフェノタイプを明らかにし、健康人の体内に自己に反応するCD8陽性T細胞がアネルギー状態で存在し、自己免疫応答を抑制していることを同定しました(図)。

図 健康人における自己免疫疾患抑制のしくみ

研究の背景

免疫系は、ウィルスなどの外来抗原に対して反応し排除しますが、自己に対しては免疫応答を起こしません(免疫自己寛容)。自己に対して免疫応答を起こさないという免疫系の原則は、胸腺での自己に対して反応するT細胞の排除(中枢性免疫寛容)と末梢での自己に対するT細胞に対する免疫不応答性(アネルギー)の誘導(末梢性免疫寛容)によって成り立っています。制御性T細胞 (Naturally occurring regulatory T cells)は、自己に反応するT細胞の活性化を抑制することで自己免疫応答(自己免疫疾患)が起こるのを阻止しています。しかしながら、制御性T細胞がどのように自己に反応するT細胞を安定的に長期間にわたり抑制しているか、またそれらの抑制された細胞は生体内でどのような特徴を持っているのかなど不明な点が多く残されていました。今回の研究で、ヒト検体を用いて制御性T細胞が自己に反応するCD8陽性T細胞を抗原刺激に不応性(アネルギー)状態にし、特徴的なフェノタイプを誘導することが明らかになり、末梢性免疫寛容での制御性T細胞の役割の重要性がさらに明確になりました。

本研究成果が社会に与える影響(本研究成果の意義)

自己に対するCD8陽性T細胞の免疫不応答(アネルギー)状態が破綻すると、自己免疫疾患を引き起こします。一方がん免疫においては、有効ながん免疫療法のためにがん抗原(多くが自己抗原である)に対する免疫不応答(アネルギー)状態を克服し、強い免疫応答を引き起こす必要があります。よって免疫不応答(アネルギー)状態の理解は、様々な免疫応答をコントロールする上で極めて重要であると考えられます。免疫不応答(アネルギー)状態の重要性は長年に渡り理解されてきたものの、アネルギー状態のT細胞のフェノタイプなど実態に対する理解が不十分で、治療等への応用が難しいと考えられてきました。

本研究成果により、制御性T細胞が自己に反応するCD8陽性T細胞に免疫不応答(アネルギー)状態を誘導し、長期間にわたる免疫寛容を成立させることが示されました。また自己免疫疾患ではこれらの自己反応性のCD8陽性T細胞の免疫不応答(アネルギー)状態が破綻していました。よって、制御性T細胞を用いて自己に反応するCD8陽性T細胞に免疫不応答(アネルギー)状態を付与することで自己免疫疾患に対する新たな治療法開発につながると考えられます。加えて免疫不応答(アネルギー)状態を克服する手法を開発することでがん免疫療法など広範な免疫治療にも応用可能であると考えられます。

掲載論文・雑誌

Yuka Maeda, Hiroyoshi Nishikawa, Daisuke Sugiyama, Danbee Ha, Masahide Hamaguchi, Takuro Saito, Megumi Nishioka, James B. Wing, Dennis Adeegbe, Ichiro Katayama and Shimon Sakaguchi
“Detection of self-reactive CD8+ T cells with an anergic phenotype in healthy individuals”
Science 2014年12月19日(金) 午前4時オンライン掲載(米国東部時間: 12月18日午後2時)

特記事項

本研究は、独立行政法人科学技術振興機構(JST)の戦略的創造研究推進事業チーム型研究(CREST)「炎症の慢性化機構の解明と制御に向けた基盤技術の創出」研究領域(宮坂昌之研究総括)における研究課題「制御性T細胞による慢性炎症制御技術の開発」(研究代表者:坂口志文)の一環として行われました。

詳しい解説

研究の手法と成果

研究グループは、まず制御性T細胞がメラノサイト自己抗原(Melan-A)特異的CD8陽性T細胞活性化時にどのような影響を与えるかを健康人末梢血単核球(以下PBMC)を用いてin vitroで検討した。健康人ドナー由来のPBMCからCD8陽性T細胞、CD25強陽性CD4陽性制御性T細胞およびT細胞除去PBMC(抗原提示細胞(以下APC) )を分離した。CFSEラベルしたCD8陽性T細胞と自己抗原(Melan-A)を提示させたAPCを共培養し、Melan-A特異的CD8陽性T細胞を誘導した。制御性T細胞を様々な比率で添加したところ、制御性T細胞の存在比率に依存してMelan-A特異的CD8陽性T細胞誘導率が低下した。さらに重要なことに、誘導されたMelan-A抗原特異的CD8陽性T細胞は、細胞分裂が1回で停止することを見出した(図1)。また、制御性T細胞により抑制され、細胞分裂が1回で停止した細胞群は、制御性T細胞非存在下で誘導した活性化Melan-A特異的CD8陽性T細胞に比べて、Melan-A抗原に対するT細胞レセプターがlow-affinityであった。また2次的抗原刺激に対してサイトカイン産生や細胞増殖を示さず、アネルギー状態であった(図2)。次にアネルギー状態のMelan-A特異的CD8陽性T細胞の分子発現を網羅的に解析したところ、特徴的なフェノタイプを有していることが明らかになった。特に細胞表面分子発現に着目したところ、ナイーブフェノタイプ(CCR7+CD45RA+) でありながら、免疫抑制分子(CTLA-4+ PD-1+)を発現し、特にCTLA-4+CCR7+により厳密に定義されることが示された(図3)。さらに、健康人の末梢血中にも自己抗原に対してアネルギー状態の自己反応性CD8陽性T細胞が存在するのかをex vivoで検討した。メラノサイト自己抗原Melan-Aに対する反応が過剰に活性化している自己免疫疾患、白斑症の検体を用いることで本メカニズムの免疫自己寛容での重要性を検討した。健康人においては自己反応性CD8陽性T細胞がアネルギー状態で存在していたが、白斑症患者ではCTLA-4+CCR7+ フェノタイプを示す細胞が認められなくなり、アネルギー状態が破綻していることが示された(図4)

以上より、制御性T細胞は自己抗原特異的T細胞の反応を抑制し、特徴的なアネルギー状態に陥らせることで、長期の免疫寛容を誘導していることが明らかになった。またこれらのアネルギー状態の細胞はCTLA-4+CCR7+により定義されることが明らかとなった。

参考図

図1 Treg存在下で誘導された自己抗原Melan-A特異的CD8陽性T細胞は細胞分裂を1回で停止する
健康人PBMCから分離したCD8 陽性T細胞 (Teff) にCFSEラベルし、Treg (CD25high CD4+) を各々の比で混合し、Melan-A抗原を提示させたAPCと共培養しMelan-A特異的CD8陽性T細胞を誘導した。Treg非存在下ではMelan-A特異的CD8陽性T細胞が効率的に誘導され、細胞分裂を繰り返した(a)。一方、Treg存在下ではMelan-A特異的CD8陽性T細胞誘導が低下し、細胞分裂が1回で停止する細胞群(b)が認められた。

図2 Treg存在で誘導されたMelan-A特異的CD8陽性T細胞はlow-affinity T細胞レセプターを持ち、アネルギー状態である
Tregの存在下で細胞分裂が1回で停止したMelan-A特異的CD8陽性T細胞(b)は、Melan-A特異的CD8陽性T細胞(a)に比較してテトラマー染色強度が低く(low affinity T細胞レセプターを持つ)、アネルギー状態(低細胞分裂能、低サイトカイン産生能)であり、2次刺激後もアネルギー状態を維持していた。

図3アネルギー状態のMelan-A特異的CD8陽性T細胞は特徴的なフェノタイプ(CCR7+CTLA-4+)を示す
Treg存在下で誘導されたMelan-A特異的CD8T細胞は、Treg非存在下で誘導されたMelan-A特異的CD8陽性T細胞とは異なる細胞表面の表現型を示し、特にCCR7/CTLA-4陽性で定義された。

ここまでのIn Vitroの実験で明らかになったこと

・Treg存在下で抗原刺激を行うと抗原特異的CD8陽性T 細胞がアネルギー状態(Low-affinity、サイトカイン産生能低下)になる。

今回新たに見出したアネルギー状態の抗原特異的(自己反応性)CD8陽性T細胞の特徴

・アナージック抗原特異的CD8陽性T細胞は細胞分裂が1回で停止する。
・ナイーブ細胞の特徴であるCCR7が陽性でありながら、免疫抑制分子であるCTLA-4も陽性というユニークなフェノタイプを示す。

Ex vivoでの検討

図4 健康人の末梢血においてlow-affinity/CTLA-4陽性CCR7陽性の自己反応性CD8陽性T細胞が存在する
健康人PBMCでも自己抗原Melan-A特異的な自己反応性CD8陽性T細胞の存在が確認された。またこの細胞群はin vitroでTreg存在下で誘導された細胞と同じくアネルギー状態であった。メラノサイトに対する免疫寛容が破綻している白斑症(Vitiligo)患者のサンプルを用いて検討したところ、白斑症ではMelan-A特異的CD8陽性T細胞はhigh-affinity T細胞レセプターを持ち、CTLA-4+CCR7+のアネルギー状態が破綻していた。

Ex vivoでの実験で明らかになったこと

・健康人末梢血中にも自己抗原に対してアネルギー状態の抗原特異的(自己反応性)CD8陽性T細胞が存在する。
・自己免疫疾患である白斑症ではこの自己反応性CD8陽性T細胞のアネルギー状態が破綻していた。

以上の検討で明らかになったこと

・Tregによって自己反応性CD8陽性T細胞はアネルギー状態(CCR7陽性CTLA-4陽性)に維持されていることが自己免疫疾患を防ぐ上で重要である。

今後の期待

・本研究により、アネルギー状態の細胞がCCR7+CTLA-4+により定義されていることが示され、体内動態などをこれらのマーカーを用いてい解析可能となり、免疫寛容研究が加速することが期待される。また、末梢性自己寛容での制御性T細胞の重要性が明確になり、これまで長年にわたり不明であった末梢性免疫寛容機構が明確に定義されていくと考えられる。

用語解説

アネルギー状態
アネルギー状態とは免疫不応答状態を指します。T細胞が抗原からの刺激に対して活性化せず反応できない状態です。自己に対するT細胞が活性化して自己免疫疾患を発症することを防ぐ上で重要な働きをしています。一方、がん免疫においては多くのがん抗原が自己抗原であるためにエフェクター細胞(がん抗原特異的CD8陽性T細胞)の不応答は有効ながん治療の妨げになります。 今まで、現象としてアネルギー状態の細胞が存在することはin vitroで明らかになっていましたが、in vivo(生体内)での詳細なフェノタイプや特徴は未だ明らかになっていませんでした。

免疫寛容
抗原分子に対して免疫応答が誘導されない状態。自己抗原に対する免疫寛容が破綻した場合、自己免疫応答 を引き起こす。

自己反応性CD8陽性T細胞
自己抗原に特異的に反応するCD8陽性T細胞。通常ではアネルギー状態と呼ばれる抗原刺激に対して無反応の状態になっています。

制御性T細胞 (Regulatory T cell :Treg)
様々な免疫応答を負に制御するT細胞。とくに自己抗原に対する免疫応答を抑制することで、免疫系の恒常性の維持で重要な働きをしています。

CTLA-4(Cyto Cytotoxic T-lymphocyte-associated antigen-4)
T細胞上に発現する免疫抑制性分子。免疫共刺激分子であるCD28と競合することにより過剰な免疫応答を抑制しています。

CCR7(C-C chemokine receptor type 7)
ケモカインレセプターの一種。リンパ節へのホーミングに重要なケモカインです。

参考URL

掲載論文
http://www.sciencemag.org/content/346/6216/1536.abstract
研究室ウェブサイト
http://exp.immunol.ifrec.osaka-u.ac.jp/

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