大阪大学大学院基礎工学研究科の岩井成憲教授、倉岡功准教授らの研究グループは、紫外線により傷付いたDNAに対して働くヌクレオチド除去修復 を蛍光で検出するためのプローブを開発し、細胞のヌクレオチド除去修復能を可視化することに成功しました。色素性乾皮症と呼ばれる遺伝性疾患ではこの修復系が機能せず皮膚がんを多発するため早期の診断が必要ですが、この研究は被検者の負担が少ない簡便な検査法の確立につながることが期待されます。

DNAやその損傷に関する予備知識

DNAは遺伝情報を保持し伝える分子ですが、それ自体の不安定性や外的要因により化学反応を受け化学構造が変化することがあります。その結果、突然変異 と呼ばれる遺伝情報の変化が起こり、細胞の死やがん化につながります。突然変異を引き起こすDNAの化学反応はDNA損傷と呼ばれますが、すべての生物はそれを修復する機構を有しています。

紫外線や発がん物質による損傷はヌクレオチド除去修復（NER） により修復されます。この修復系では、損傷の認識、損傷を含むDNA断片の切り出し、1本鎖部分でのDNA合成とつなぎ合わせの各段階が多種類のタンパク質により連続的に行われます （図1） 。

しかし、NERに関与するタンパク質のいずれかが機能しない遺伝性の疾患が知られており、代表的なものとして日光に当たると皮膚がんを多発する色素性乾皮症（XP） があります。

その発生頻度は日本人で高く22,000人に1人という研究報告があり、早期の診断が必要です。現在用いられている検査法では、被検者の皮膚を少し切り取って細胞を培養し、その細胞に紫外線を照射して不定期DNA合成が調べられます。 図1 のDNAポリメラーゼによるDNA合成でヌクレオチド（DNAの構成単位）がどの程度取り込まれるかを、放射線を使って調べるわけです。

本研究グループは損傷DNAの化学合成法の開発とその応用に関する研究を行ってきましたが、今回、NERを蛍光で検出するためのプローブ を開発し、細胞のNERの能力を可視化することに成功しました。このプローブは、紫外線損傷の一つでNERの良い基質となる(6-4)光産物 、蛍光色素であるフルオレセイン、消光剤であるダブシルを同じ鎖に有する2本鎖の環状DNAで、NERにより損傷を含むDNA断片が切り出されると、それが細胞中のヌクレアーゼ（核酸分解酵素）で分解され蛍光色素が消光剤から離れて蛍光を発するという原理です （図2） 。このようなプローブDNAを作製し、ヒトの培養細胞に入れて蛍光顕微鏡で観察するとプローブ中に(6-4)光産物がある場合にのみ （図3左） 、XP患者の培養細胞（NER - 細胞）とその細胞で機能していないタンパク質を遺伝子導入により補充した細胞（NER + 細胞）に入れた場合にはNER活性に依存して （図3右） 、蛍光が検出されました。なお、蛍光が検出されない場合でもプローブが細胞に入っていることは、別途開発したトランスフェクションレポーター により確認しています。

本研究で開発したプローブは市販の導入試薬を用いて細胞に入れるだけでNERを直接検出することができるため、XPを診断するための簡便な検査法になりうると考えています。また、白血球細胞を用いることができれば皮膚を切り取らなくても採血で検査することができるため、被検者の負担を大幅に軽減することが可能となります。また、従来法では細胞に紫外線を照射するため脂質の酸化などの副反応が紫外線損傷DNAの修復に影響する可能性がありますが、本方法ではNERによる損傷除去のみを直接観察できるため、DNA修復機構の解明など生物学の研究に対する貢献も期待されます。

本研究成果は、英国時間7月4日（金）10:00（日本時間4日（金）18:00）に英国の電子ジャーナル「Scientific Reports」で公開されます。

なお、本研究は神戸大学大学院医学研究科の錦織千佳子教授、神戸大学バイオシグナル研究センターの菅澤薫教授との共同研究です。

図1　ヌクレオチド除去修復（NER）

図2　NERを検出するためのプローブと検出の原理

図3　NERが正常な細胞（左）とXP細胞（右）でのNERの検出（NER＋は遺伝子導入によりNERを回復させた）